普通小球藻无污染培养、氧胁迫缓解及油脂积累的研究

论文摘要

微藻在保健食品、水生动物及化妆品等领域已获得广泛的商业应用,化石燃料的日益枯竭和其燃烧引起的环境问题,使微藻生物柴油尽快商业化成为各界追求的目标。微藻工业生产面临的关键问题是培养成本与能源消耗过高,生物污染特别是原生动物鞭毛虫的污染及氧胁迫造成的产率低是重要的原因。论文以淡水绿藻普通小球藻为研究对象,以提高油脂产率LP或细胞产率为研究目标,以非无菌条件下低成本、无污染培养小球藻以及在不增加脱氧设备的前提下缓解氧胁迫对细胞的伤害为研究策略,不断优化培养条件,并对三重胁迫提高油脂含量LC进行了研究,为微藻特别是淡水藻的大规模培养提供理论依据和技术支持。（1）在培养基中添加一定浓度NaHCO3并控制pH 9.5可完全抑制鞭毛虫的生长。通过等渗透压培养、DNA凝胶电泳图谱分析、细胞完好性鉴定、细胞形态观察及细胞活性研究等方法,发现初始pH 9.5的160 mM的四种无机盐都能不同程度地抑制鞭毛虫的生长,抑制效果大小排序是NaHCO3﹥KHCO3﹥NaCl﹥KCl。pH 7.5-9.5的160 mM NaHCO3能有效抑制鞭毛虫的生长,抑制效果随着pH的上升而增强,pH 9.5时很难观察到鞭毛虫的存在。细胞膜破损和调节性细胞容积增大功能受损是鞭毛虫致死的两种可能机制。（2）选取抑制鞭毛虫效果最佳的NaHCO3,系统考察其对小球藻的影响,并与NaCl比较。结果显示加入NaHCO3能起到稳定培养液pH的作用。在0-80 mM范围内,NaHCO3浓度增加可为藻细胞提供更多的碳源,促进细胞生长;NaHCO3浓度过高如160 mM则会抑制细胞生长,细胞密度显著低于160 mM NaCl组。同时发现NaHCO3会使单个细胞质量和体积显著增大,并引起藻细胞团聚。与NaCl相比,NaHCO3对细胞生长的影响要复杂得多,由于培养条件的不可控性,因此在锥形瓶中并不能清晰了解胁迫作用的确切机制。（3）为了深入研究NaHCO3与NaCl对小球藻的不同影响,在锥形瓶研究的基础上,将实验放大到3 L光生物反应器中进行并严格控制培养参数。结果表明,在pH 7.5、8.5及9.5的条件下,160 mM NaCl组的DCWmax均大于相同pH条件下的160 mM NaHCO3组。培养液加入NaHCO3后细胞生长最佳pH由7.5变为8.5,这归因于NaHCO3的加入提高了溶解CO2浓度[dCO2]。NaHCO3比NaCl更能促进油脂积累,pH 9.5的160 mM NaHCO3条件下获得了最高LC和LP,分别为494 mg?g-1和44.5mg?L-1?d-1。溶解无机碳（DIC）对油脂生成的刺激作用可能是高pH条件下的高[CO32-]所致。160 mM NaHCO3引起的细胞团聚是小球藻缓解高浓度DIC压力的一种应激机制,且细胞团聚需要氮元素的参与。实验结果说明NaHCO3对藻细胞的影响与NaCl或盐度的影响有区别。160 mM NaHCO3的培养基都未灭菌,且都未发现鞭毛虫污染。（4）探讨氧胁迫对小球藻的有害影响,深入分析NaHCO3缓解氧胁迫的机制。结果表明,培养液中高溶解氧浓度[dO2]的氧胁迫对细胞的生长和代谢均有不利影响,降低了LP和细胞产率,有害影响程度与活性氧ROS含量正相关。在高[dO2]（400%饱和溶解氧）条件下,在培养基中加入160 mM NaHCO3,缓解了部分氧胁迫的副作用,LP和细胞产率分别提高了139%和98%。NaHCO3缓解氧胁迫的机制主要有两条:一是显著增强了ROS酶类清除系统;二是激活了CO2浓缩机制,增加了光合作用而抑制了光呼吸作用。（5）研究三重胁迫对小球藻油脂积累的影响。结果显示,在前述实验pH 9.5+160 mM NaHCO3或pH 9.5+160 mM NaCl双重胁迫的基础上,引入氮限制形成三重胁迫,发现LC均有一定程度的提高,且pH 9.5+160mM NaHCO3+氮限制条件下LC高达510 mg?g-1。在胞外氮源耗尽之后,细胞将被迫消耗叶绿素来继续生长,因此光合作用效率和细胞生长速率均有所下降;与此同时,细胞改变代谢途径而积累油脂。论文从锥形瓶、培养瓶到3 L光生物反应器的一系列放大实验中,加入160 mM NaHCO3的培养基都未灭菌,在pH 7.5-9.5时都有效抑制了鞭毛虫污染,特别在pH 9.5时很难观察到鞭毛虫的存在,实现了非无菌条件下低成本、无污染培养小球藻。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 微藻简介
•     1.1.1 微藻的商业价值
•     1.1.2 微藻生物柴油
•     1.1.3 微藻培养模式
•     1.1.4 微藻培养体系
•   1.2 微藻培养中的生物污染
•     1.2.1 生物污染
•     1.2.2 生物污染的控制方法
•     1.2.3 鞭毛虫污染控制的研究动态
•   1.3 影响微藻生长的非生物因素
•     1.3.1 碳源
•     1.3.2 氮源
•     1.3.3 磷源
•     1.3.4 其它元素
•     1.3.5 pH
•     1.3.6 光照强度和光照质量
•     1.3.7 温度
•   1.4 微藻的环境胁迫与油脂积累
•     1.4.1 微藻油脂的生物合成
•     1.4.2 提高微藻油脂含量的方法
•     1.4.3 盐胁迫及碱胁迫
•     1.4.4 氮胁迫
•   1.5 氧胁迫的危害及缓解策略
• 2对光合作用的竞争性抑制'>    1.5.1 O₂对光合作用的竞争性抑制
•     1.5.2 ROS对微藻生长的影响
•     1.5.3 缓解氧胁迫对微藻影响的方法
•   1.6 研究的目的及主要内容
•     1.6.1 研究目的及意义
•     1.6.2 研究的主要内容
• 第二章 无机盐对鞭毛虫的抑制作用及其机理研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与仪器
•     2.2.1 实验藻种
•     2.2.2 实验鞭毛虫
•     2.2.3 培养基
•     2.2.4 主要试剂
•     2.2.5 实验仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 普通小球藻的预培养
•     2.3.2 搅拌罐式PBR中普通小球藻的的培养
•     2.3.3 细胞干重测定
•     2.3.4 鞭毛虫预培养
• 3和pH抑制鞭毛虫污染实验'>    2.3.5 NaHCO₃和pH抑制鞭毛虫污染实验
•     2.3.6 鞭毛虫与普通小球藻共同培养时PEG200 或四种无机盐对鞭毛虫影响实验
•     2.3.7 盐处理后的鞭毛虫转移培养实验
•     2.3.8 鞭毛虫细胞形态观察、细胞直径及细胞密度测定
•     2.3.9 鞭毛虫DNA的提取方法
•     2.3.10 锥虫蓝鉴定方法
• 3等渗透压的PEG200 浓度计算'>    2.3.11 与160 mM NaHCO₃等渗透压的PEG200 浓度计算
•   2.4 结果与讨论
• 3和pH对鞭毛虫污染的抑制'>    2.4.1 NaHCO₃和pH对鞭毛虫污染的抑制
• 3所形成的渗透压无法单独抑制鞭毛虫生长'>    2.4.2 160 mM NaHCO₃所形成的渗透压无法单独抑制鞭毛虫生长
•     2.4.3 细胞程序化死亡不是无机盐抑制鞭毛虫生长的机制
•     2.4.4 四种无机盐对鞭毛虫生长的影响
•     2.4.5 四种无机盐处理后鞭毛虫细胞活性变化及细胞膜完好性
•     2.4.6 鞭毛虫致死的另一个可能机制:调节性细胞容积增大功能受损
•   2.5 本章小结
• 3对普通小球藻细胞生长细胞形态的影响及其机理研究'>第三章 NaHCO₃对普通小球藻细胞生长细胞形态的影响及其机理研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与仪器
•     3.2.1 主要试剂
•     3.2.2 实验仪器
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 普通小球藻的培养
•     3.3.2 普通小球藻与鞭毛虫共同培养
•     3.3.3 普通小球藻细胞密度测定
•     3.3.4 普通小球藻细胞形态观察及细胞直径测定
•     3.3.5 比生长速率计算
•   3.4 结果与讨论
• 3对普通小球藻生长的影响'>    3.4.1 低浓度（0-5 mM）NaHCO₃对普通小球藻生长的影响
• 3对普通小球藻生长的影响'>    3.4.2 较高浓度（10-160 mM）NaHCO₃对普通小球藻生长的影响
• 3和KHCO₃对普通小球藻和鞭毛虫生长的影响'>    3.4.3 NaHCO₃和KHCO₃对普通小球藻和鞭毛虫生长的影响
• 3和NaCl对普通小球藻生长影响的比较'>    3.4.4 NaHCO₃和NaCl对普通小球藻生长影响的比较
• +、Na⁺、HCO₃^–及Cl^–四种离子对普通小球藻生长的影响'>    3.4.5 K⁺、Na⁺、HCO₃^–及Cl^–四种离子对普通小球藻生长的影响
• 3和NaCl的组合对普通小球藻生长的影响'>    3.4.6 NaHCO₃和NaCl的组合对普通小球藻生长的影响
•   3.5 本章小结
• 第四章 溶解无机碳及pH对普通小球藻生长和油脂积累的影响
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料与仪器
•     4.2.1 主要试剂
•     4.2.2 实验仪器
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 油脂含量测定及油脂产率计算
•     4.3.2 不同pH条件下DIC各组分在DIC中占比及浓度计算
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 160 mM NaCl及 pH对普通小球藻细胞生长和油脂积累的影响
• 3及pH对普通小球藻细胞生长和油脂积累的影响'>    4.4.2 160 mM NaHCO₃及pH对普通小球藻细胞生长和油脂积累的影响
•     4.4.3 pH和 DIC各组分对细胞生长和油脂积累的影响
•     4.4.4 普通小球藻的细胞团聚
•     4.4.5 氮元素在普通小球藻细胞团聚的作用
•     4.4.6 搅拌速率对普通小球藻的影响
•   4.5 本章小结
• 第五章 缓解氧胁迫对普通小球藻影响的研究
•   5.1 引言
•   5.2 实验材料与仪器
•     5.2.1 主要试剂
•     5.2.2 实验仪器
•   5.3 实验方法
• 2]的测定与控制'>    5.3.1 培养液[dO₂]的测定与控制
•     5.3.2 两种普通小球藻破壁法
•     5.3.3 CA酶活性测定
•     5.3.4 APX酶活性测定
•     5.3.5 CAT酶活性测定
•     5.3.6 细胞活性氧含量测定
•   5.4 结果与讨论
•     5.4.1 普通小球藻破壁方法研究
• 3对细胞生长及油脂积累的影响'>    5.4.2 氧胁迫和NaHCO₃对细胞生长及油脂积累的影响
• 3缓解氧胁迫的可能机制之一:藻细胞ROS酶类清除系统显著增强..'>    5.4.3 NaHCO₃缓解氧胁迫的可能机制之一:藻细胞ROS酶类清除系统显著增强..
• 3抗氧胁迫机制二:二氧化碳浓缩机制的激活'>    5.4.4 NaHCO₃抗氧胁迫机制二:二氧化碳浓缩机制的激活
•     5.4.5 高[dO2]条件下pH对普通小球藻细胞生长及油脂积累的影响
•   5.5 本章小结
• 3及高pH双重胁迫条件下氮源浓度对普通小球藻生长与细胞油脂积累的影响'>第六章 NaCl或者NaHCO₃及高pH双重胁迫条件下氮源浓度对普通小球藻生长与细胞油脂积累的影响
•   6.1 引言
•   6.2 实验材料与仪器
•     6.2.1 主要试剂
•     6.2.2 实验仪器
•   6.3 实验方法
•     6.3.1 叶绿素含量测定
• 3浓度的测定'>    6.3.2 NaNO₃浓度的测定
•   6.4 结果与讨论
• 3及高pH双重胁迫条件下氮源浓度对细胞生长及油脂积累的影响'>    6.4.1 NaHCO₃及高pH双重胁迫条件下氮源浓度对细胞生长及油脂积累的影响
•     6.4.2 NaCl及高pH双重胁迫条件下氮源浓度对细胞生长及油脂积累的影响
• 3胁迫在三重胁迫中的效应'>    6.4.3 160 mM NaCl胁迫与160 mM NaHCO₃胁迫在三重胁迫中的效应
•   6.5 本章小结
• 第七章 结论与展望
•   7.1 结论
•   7.2 创新之处
•   7.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 博士期间发表论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李静雅

导师: 廖丹葵

关键词: 普通小球藻,鞭毛虫,碳酸氢钠,氧胁迫,油脂积累

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 广西大学

基金: 广西石化资源加工及过程强化技术重点实验室,NSERC (Natural Science and Engineering Research Council of Canada)项目

分类号: Q94;TQ645

DOI: 10.27034/d.cnki.ggxiu.2019.000019

总页数: 159

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