奇异变形杆菌醇脱氢酶的克隆表达及酶学性质研究

论文摘要

醇脱氢酶（ADHs,EC 1.1.1.1）,是属于氧化还原酶的第一亚类,该酶通常可以使用NAD（P）H作为辅酶将醛或酮转化为相对应的醇。醇脱氢酶由于其各种独特的生理生化性质和酶学性质,因而被广泛的应用于各个方面,主要是医学研究、化工生产、食品研究以及生物工程研究。在本论文中,在大肠杆菌中成功地表达了5个来源于奇异变形杆菌Proteus mirabilis JN458中的醇脱氢酶,优化了表达质粒和诱导条件,并探究了五种醇脱氢酶的酶学性质,为研究奶酪芳香气味的产生奠定了分子生物学基础。主要研究结果如下:（1）成功克隆了5个来源于P.mirabilis JN458的醇脱氢酶基因（adh1、adh2、adh3、adh4、adh5）,将5个基因成功与pColdⅡ质粒相连,构建重组质粒后,将其转入Escherichia coli BL21（DE3）中并对其进行表达。预测得到的5个醇脱氢酶的蛋白分子量分别为40.1kDa、41.3 kDa、42.4 kDa、39.3 kDa和37.3 kDa。酶活验证发现5个醇脱氢酶对苯乙醛均具有一定的酶活。（2）由于pColdⅡ质粒的蛋白表达量和酶活不高,因此对表达质粒和重组菌株诱导条件进行了优化。选择pET28a、pETDuet-1、pRSFDuet-1和pColADuet-1进行表达质粒优化,分别构建了重组质粒pET28a-adh1,pETDuet-1-adh1,pRSFDuet-1-adh1和pColADuet-1-adh1,最终选择pETDuet-1作为表达质粒。最佳的诱导条件:培养基初始pH为6.5,诱导初始细胞的浓度OD600为0.4,诱导剂IPTG的浓度为0.4 mmol·L-1,诱导温度为15℃,诱导后培养时间为18 h,摇床转速为220 r·min-1,在此条件下,酶活比优化前提高了77%。（3）采用镍柱和脱盐柱对ADHs进行蛋白纯化,并研究了5种醇脱氢酶的酶学性质。ADH-1、ADH-2和ADH-3的最适pH为7.0,ADH-4和ADH-5的最适pH为8.0,ADH-1、ADH-3和ADH-5的最适温度为40℃,ADH-2和ADH-4的最适温度为45℃。5种醇脱氢酶都有广泛的底物范围。5个酶关于苯乙醛、2-甲基丁醛和戊醛的动力学参数如下:对于ADH-1,Km分别为34.55、6.44和4.23mmol·L-1;对于ADH-2,Km分别为16.90、3.13和4.93mmol·L-1;对于ADH-3,Km分别为10.01、4.42和5.04mmol·L-1;对于ADH-4,Km分别为4.66、14.81和5.22mmol·L-1,;对于ADH-5,Km分别为19.64、24.62和1.33mmol·L-1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 醇脱氢酶
•     1.1.1 醇脱氢酶的简介
•     1.1.2 醇脱氢酶的来源
•     1.1.3 醇脱氢酶的分类
•     1.1.4 醇脱氢酶的结构
•     1.1.5 醇脱氢酶的催化历程
•     1.1.6 醇脱氢酶的性质
•     1.1.7 醇脱氢酶的应用
•     1.1.8 醇脱氢酶的研究进展
•   1.2 论文的立题依据和意义
•   1.3 论文的研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌种与质粒
•     2.1.2 主要实验仪器
•     2.1.3 酶与实验药品
•     2.1.4 培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 P.mirabilis JN458基因组的提取
•     2.2.2 E.coli感受态细胞的制备和转化
•     2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
•     2.2.4 ADHs基因的克隆和重组菌株的构建
•     2.2.5 重组大肠杆菌的诱导表达
•     2.2.6 表达质粒的选择
•     2.2.7 重组大肠杆菌的生长曲线
•     2.2.8 重组大肠杆菌诱导条件的优化
•     2.2.9 蛋白电泳
•     2.2.10 蛋白浓度测定
•     2.2.11 ADHs的分离纯化
•     2.2.12 ADHs的酶活测定
•     2.2.13 苯乙醇的高效液相色谱检测
•     2.2.14 ADHs酶学性质研究
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 ADHs的预测及克隆表达验证
•     3.1.1 ADHs的预测
•     3.1.2 ADHs的基因克隆
•     3.1.3 ADHs的表达验证
•     3.1.4 ADHs的序列分析
•   3.2 质粒的选择
•     3.2.1 质粒的选择
•     3.2.2 不同重组质粒酶活验证
•   3.3 诱导条件的优化
•     3.3.1 培养基的初始pH的优化
•     3.3.2 诱导初始细胞浓度的优化
•     3.3.3 诱导剂浓度的优化
•     3.3.4 诱导温度的优化
•     3.3.5 诱导后的培养时间的优化
•     3.3.6 摇瓶溶氧的优化
•   3.4 ADHs的分离纯化
•   3.5 ADHs的酶学性质
•     3.5.1 ADHs的最适反应pH和 pH稳定性
•     3.5.2 ADHs的最适反应温度和温度稳定性
•     3.5.3 ADHs的底物特异性
•     3.5.4 金属离子、EDTA对酶活性的影响
•     3.5.5 ADHs的动力学参数
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1：作者在攻读硕士学位期间的科研成果
• 附录2：苯乙醇标准曲线测定图

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 于凤川

导师: 蔡宇杰

关键词: 奇异变形杆菌,醇脱氢酶,克隆表达,酶学性质

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学

分类号: Q78

总页数: 50

文件大小: 2119K

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