转录组水平箭筈豌豆ILP标记及AQP基因家族的鉴定和功能分析

论文摘要

植物种质资源的创新与利用离不开分子标记的开发及相关抗性基因的挖掘。作为一种重要的豆科经济牧草,箭筈豌豆（Vicia sativa L.）具有丰富的营养价值、生物固氮及饲用等广泛用途。然而,由于其基因组数据的缺乏,目前对该草属种间关系及遗传多样性的研究多集中在形态学水平,在分子水平上的相关研究仍相对滞后。随着高通量转录组测序的发展,利用转录组数据对箭筈豌豆分子标记的开发及关键基因家族的鉴定成为可能。内含子长度多态性（intron-length polymorphic,ILP）分子标记具有数量丰富、共显性、多态性高等特点,可用于分子辅助育种和遗传图谱构建,但其在箭筈豌豆中的研究尚未见报道。水通道蛋白（aquaporin,AQP）家族在植物水分转运及耐旱性机制方面扮演着重要角色,其相关研究在箭筈豌豆中仍是空白。本研究利用已获得箭筈豌豆转录组数据,在转录组水平对箭筈豌豆ILP标记进行开发,并对其多态性和通用性进行评价,可为今后箭筈豌豆种质资源评价和比较基因组学研究提供分子标记资源。同时,在转录组水平系统鉴定和分析AQP基因家族及其抗旱功能,可为后期箭筈豌豆分子抗旱育种提供宝贵基因资源。主要研究结果如下:1.通过箭筈豌豆转录本序列与蒺藜苜蓿、大豆和拟南芥基因组序列比对分析,在44,582个unigene序列中共鉴定出10,400个内含子位置信息,并用于ILP分子标记引物设计。在随机选取的300对VsILP标记中,283（84.8%）个在箭筈豌豆中能够成功扩增。其中,41对引物在30个箭筈豌豆品种中表现出扩增产物的多态性,共产生166个等位基因,每个基因座平均有4.0个等位基因。多态性信息含量（PIC）在0.06-0.81之间,平均为0.49。在283个VsILP标记中,84.4%的引物在豆科植物和非豆科植物中表现出通用性。2.在转录组水平共鉴定出21个箭筈豌豆AQP（VsAQP）基因。基于系统发育分析,VsAQP可被分为四个亚家族,其中包括4个质膜水孔蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）、7个类Nodulin（NOD26）膜内在水孔蛋白（NOD26-like intrinsic protein,NIP）、6个液泡膜内在水孔蛋白（tonoplast intrinsic protein,TIP）以及4个小碱性膜内蛋白（small basic intrinsic protein,SIP）。蛋白关键残基的分析表明,每种VsAQP应具有除水外的其它小分子底物特异性。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析其在干旱胁迫下不同组织中的表达水平,表明多数VsPIPs和VsTIPs亚族在根、茎、叶三个组织中的不同时间段分别呈现出显著的上调表达,推测这些基因可能在植物受干旱胁迫期间调节水转运方面发挥作用。酵母中异源表达实验表明VsPIP1;2和VsPIP2;2具有提高酵母细胞的抗旱能力,二者可能是箭筈豌豆在响应干旱胁迫过程中发挥重要作用的关键基因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第二章 文献综述
•   2.1 箭筈豌豆研究进展
•     2.1.1 箭筈豌豆概述
•     2.1.2 箭筈豌豆的遗传多样性研究
•     2.1.3 箭筈豌豆的抗旱性研究
•   2.2 ILP标记概况
•     2.2.1 植物内含子概述
•     2.2.2 分子标记概述
•     2.2.3 ILP标记概述
•     2.2.4 ILP标记的应用
•   2.3 AQP蛋白家族概述
•     2.3.1 AQP蛋白结构概述
•     2.3.2 植物AQP蛋白研究概述
•     2.3.3 AQP蛋白在植物响应干旱胁迫中的作用
•   2.4 本研究的目的意义和技术路线图
•     2.4.1 本研究的目的和意义
•     2.4.2 技术路线图
• 第三章 箭筈豌豆VSILP标记的开发与应用
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 试验材料
•     3.1.2 DNA的提取与检测
•     3.1.3 数据来源和引物的设计
•     3.1.4 PCR扩增与凝胶电泳
•     3.1.5 PCR扩增产物的测序
•     3.1.6 引物多态性分析
•     3.1.7 遗传多样性与种群结构
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 内含子位置鉴定
•     3.2.2 VsILP标记遗传多样性分析
•     3.2.3 基于VsILP标记箭筈豌豆种质遗传多样性分析
•     3.2.4 30份箭筈豌豆种群结构分析
•     3.2.5 VsILP标记通用性及遗传多样性分析
•     3.2.6 VsILP233扩增产物测序结果与分析
•   3.3 讨论
• 第四章 箭筈豌豆AQP基因家族的鉴定及功能分析
•   4.1 材料与试剂
•     4.1.1 菌株和质粒
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 植物材料和处理
•     4.1.4 数据来源
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 箭筈豌豆AQP基因家族的鉴定
•     4.2.2 系统发育分析和命名
•     4.2.3 VsAQP蛋白序列分析
•     4.2.4 总RNA的提取
•     4.2.5 cDNA的合成和检测
•     4.2.6 实时荧光定量PCR和数据分析
•     4.2.7 目的基因的克隆与回收
•     4.2.8 目的片段的连接
•     4.2.9 重组子的转化和阳性筛选
•     4.2.10 质粒抽提
•     4.2.11 酵母表达载体的构建
•     4.2.12 酵母感受态的制备和转化
•     4.2.13 转基因酵母细胞的耐旱性测试
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 VsAQP基因的鉴定与分类
•     4.3.2 VsAQP蛋白的理化性质分析
•     4.3.3 VsAQP蛋白序列的保守性分析
•     4.3.4 干旱胁迫下VsAQP基因的表达模式
•     4.3.5 VsPIP1;2和VsPIP2;2的克隆和酵母转化
•     4.3.6 酵母表达载体的构建和鉴定
•     4.3.7 VsPIP1;2和VsPIP2;2可提高酵母抗旱性
•   4.4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 在学期间的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韦兴燚

导师: 刘文献

关键词: 箭筈豌豆,遗传多样性,干旱胁迫

来源: 兰州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 兰州大学

分类号: Q943.2;S542.9

总页数: 75

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