基于黄瓜绿斑驳花叶病毒的VIGS载体构建

论文摘要

葫芦科作物是我国重要的水果和蔬菜,新品种的培育需要挖掘重要农艺性状的基因。黄瓜、西瓜和甜瓜等多种葫芦科作物基因组已被测序,这为优异基因的挖掘及其功能研究奠定了基础。葫芦科作物的遗传转化耗时费力且转化效率极低,病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术为葫芦科作物功能基因组学的研究提供了便利。本研究选择在自然条件下可侵染葫芦科作物的黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）为材料,采用该病毒的侵染性克隆,首先摸索外源基因片段插入的位点、其次鉴定外壳蛋白（Coat Protein,CP）亚基因组启动子（Subgenomic Promoter,SGP）,再分析沉默效应,从而构建了可用于研究葫芦科植物基因功能的VIGS载体。本文主要的研究结果如下:（1）明确了插入位点在CGMMV CP基因终止密码子与3’非编码区之间,不适合用于构建VIGS载体。在CGMMV侵染性克隆pXT1-CGMMV的基础上,通过点突变和同源重组的技术采取分段扩增的方式获得含单酶切位点HindIII的病毒载体1a23,经接种寄主植物表现的症状及结合DAS-ELISA和RT-PCR等检测证明该载体具侵染性。在此基础上构建了插入不同长度的八氢番茄红素脱氢酶基因（Phytoene desaturase,PDS）片段（114 bp、213 bp和300 bp）的VIGS载体,明确了该载体可承载的目标基因的长度为114 bp,但载体本身病毒症状太强覆盖了沉默表型。（2）鉴定了CGMMV CP的亚基因组启动子SGP。通过点突变和同源重组的方法对pXT1-CGMMV进行突变,构建了7个MP部分缺失的突变体和10个CP部分缺失的瞬时表达绿色荧光蛋白（Enhancedgreen fluorescent protein,EGFP）的载体,经Northern Blot和qRT-PCR对CP亚基因组RNA的积累量和EGFP的相对表达量的检测确定CGMMV CP的SGP活性区域,并结合生物信息学手段进行进一步验证。（3）构建了包含重复190 bp的CGMMV CP亚基因组启动子和一个单限制性酶切位点Bam HI的VIGS载体:CGMMV-BamHI。基于CGMMV CP亚基因组启动子鉴定的信息,确定了构建CGMMV VIGS载体的合适的插入位点,并证实了插入片段在100 bp300 bp均可诱导葫芦科作物相关基因（PDS）的沉默,插入片段为69 bp的发夹结构时,接种植物出现光漂白表型时间较早,沉默效率介于插入片段为150 bp与213 bp的载体之间。本文明确了采用CGMMV病毒构建VIGS载体时外源基因片段的插入位点,鉴定了CGMMV亚基因组启动子,成功构建了基于VIGS载体,该载体具有引发症状轻微、沉默效率高等特点,为研究葫芦科作物基因功能提供了平台技术,必将有力促进葫芦科作物相关优异基因的挖掘与鉴定。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 现有研究葫芦科作物基因功能的技术
•   1.2 病毒诱导的基因沉默
•     1.2.1 病毒诱导的基因沉默的发展
•     1.2.2 VIGS的技术原理
•     1.2.3 VIGS的优点
•     1.2.4 VIGS载体在葫芦科作物中的应用
•   1.3 亚基因组RNA
•   1.4 亚基因组启动子
•   1.5 黄瓜绿斑驳花叶病毒
•     1.5.1 黄瓜绿斑驳花叶病毒特性
•     1.5.2 基于CGMMV植物病毒载体的研究进展
•   1.6 本研究的目的与意义
•   1.7 本研究的技术路线
• 第二章 CGMMV CP基因后插入位点构建VIGS载体
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 供试材料
•     2.1.2 菌株与CGMMV侵染性克隆
•     2.1.3 试剂盒与其他试剂
•     2.1.4 引物
•     2.1.5 试验仪器
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 分析pXT1与CGMMV基因组序列的酶切位点
•     2.2.2 CGMMV CP基因后插入位点的病毒载体的构建
•     2.2.3 葫芦科作物PDS基因的克隆
•     2.2.4 葫芦科作物PDS VIGS载体的构建
•     2.2.5 载体的农杆菌浸润接种
•     2.2.6 载体接种后检测
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 pXT1与CGMMV基因组序列酶切位点的分析
•     2.3.2 CGMMV CP基因后插入位点的VIGS载体的构建
•     2.3.3 载体的侵染性及其沉默效果检测分析
•   2.4 讨论
• 第三章 CGMMV CP亚基因组启动子的鉴定
•   3.1 试验材料
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 技术路线
•     3.2.2 RNA二级结构的预测
•     3.2.3 CP部分缺失的瞬时表达载体的构建及EGFP表达量的检测
•     3.2.4 突变体（MP部分缺失）的构建及侵染性的检测
•     3.2.5 生物信息学分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 CGMMV CP SGP下游区域的绘制
•     3.3.2 CGMMV CP SGP上游区域的鉴定
•     3.3.3 生物信息学分析验证
•   3.4 讨论
• 第四章 利用亚基因组启动子构建VIGS载体
•   4.1 试验材料
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 含CGMMV CP亚基因组启动子的病毒载体的构建策略
•     4.2.2 CGMMV-Bam HI的构建及侵染性的检测
•     4.2.3 葫芦科作物和本生烟PDS基因的克隆
•     4.2.4 含PDS基因片段的CGMMV VIGS载体的构建及沉默效应的检测
•     4.2.5 CGMMV-Bam HI-PDS69 载体的构建及沉默效应的检测
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 CGMMV-Bam HI的构建及其在葫芦科作物中侵染性的检测
•     4.3.2 含不同大小PDS片段的CGMMV-Bam HI沉默效应检测
•     4.3.3 CGMMV-Bam HI-PDS69 载体的构建及沉默效应的检测
•   4.4 讨论
• 第五章 全文结论
•   5.1 主要结论
•   5.2 创新点
•   5.3 下一步工作展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘美

导师: 古勤生

关键词: 黄瓜绿斑驳花叶病毒,外壳蛋白,亚基因组启动子,病毒诱导的基因沉默,葫芦科作物

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 中国农业科学院

基金: 国家自然科学基金(31572147),国家西甜瓜产业技术体系(CARS-26-13),中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP-2018-ZFRI-08)

分类号: S432.41

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