希瓦氏菌中两个肽聚糖合成酶复合体的生理功能及补偿研究

论文摘要

高分子量青霉素结合蛋白（Penicillin binding proteins,PBPs）是主要的肽聚糖合成酶,也是β-内酰胺类抗生素的作用靶点。Escherichia coli中,PBP1a和PBP1b分别与外膜脂蛋白LpoA和LpoB形成肽聚糖合成酶复合体,共同参与肽聚糖的合成。两个复合体之间功能冗余,同时缺失导致细胞死亡。Shewanella oneidensis是一种革兰氏阴性菌,前期研究发现该菌也含有两个肽聚糖合成酶复合体（PBP1a/LpoA和PBP1b/LpoB）,但二者之间具有不同的生理功能。其中,PBP1a/LpoA复合体缺失后细菌生长变缓,并且对β-内酰胺类抗性增强;而PBP1b/LpoB复合体缺失后无此影响。基于此,本研究系统性比较了两个复合体缺失后的表型差异,并对其内在机制进行深入研究,其结果如下:PBP1a/LpoA缺失的菌株表现出诸多生理缺陷,如细胞形态由杆状变成球形、在不含NaCl的低渗培养基（NaCl-less）中无法生长、对十二烷基磺酸钠（SDS）敏感性增强等;而PBP1b/LpoB缺失的菌株无此表型缺陷。进一步研究发现,PBP1a/LpoA缺失的菌株对万古霉素和N-苯基-1-萘胺（NPN）的摄取能力增强,表明PBP1a/LpoA缺失后,细胞外膜通透性增强,细胞壁完整性受损。基于上述生理表型差异,本研究通过在PBP1a和LpoA同时缺失的菌株（ΔmrcAΔlpoA）中诱导表达PBP1b后发现,当诱导剂浓度较低时突变株的表型可以回复,而诱导剂浓度较高时突变株的表型无法回复。另外,PBP1b由3个结构域组成,任何结构域的缺失均不能使突变株表型回复。因此,PBP1b的上调表达可在功能上完全补偿PBP1a/LpoA。随后,本研究以ΔmrcAΔlpoA菌株为亲本,利用转座子随机插入突变技术筛选表型回复的突变株（即抑制子）。总计获得13株抑制子,通过随机引物PCR（AP-PCR）以及生物信息学分析发现,转座子集中插入于hrpB、sspA和vanZ基因中。其中,hrpB编码ATP依赖型解旋酶,位于mrcB（编码PBP1b）上游;sspA编码严谨饥饿蛋白;vanZ编码VanZ家族蛋白。与hrpB抑制子表型不同的是,hrpB基因的无痕敲除并不能使ΔmrcAΔlpoA菌株表型回复,表明hrpB抑制子表型回复并非hrpB失活导致。鉴于本研究所用转座子中含有隐藏启动子,推测hrpB抑制子中mrcB基因表达增强,从而在功能上补偿PBP1a。qRT-PCR分析显示hrpB抑制子中mrcB的表达量与亲本相比明显增强。因此,hrpB抑制子表型回复是由PBP1b表达增强所致。与sspA抑制子表型一致的是,sspA基因的无痕敲除使ΔmrcAΔlpoA表型回复,并且能被S.oneidensis和E.coli的sspA遗传回补。qRT-PCR分析显示sspA缺失的突变株中PBP1b表达量显著上调,表明sspA在转录水平上负调控PBP1b的表达,从而影响对PBP1a/LpoA的功能补偿。进一步研究发现SspA并非直接调控PBP1b,可能通过类核蛋白H-NS调控PBP1b表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
•   1.1 细菌肽聚糖
•     1.1.1 细菌细胞壁
•     1.1.2 肽聚糖的化学组成和结构特点
•     1.1.3 肽聚糖的生物合成与重塑
•     1.1.4 肽聚糖循环和β-内酰胺酶表达之间的关系
•   1.2 青霉素结合蛋白
•     1.2.1 青霉素结合蛋白命名及分类
•     1.2.2 青霉素结合蛋白的功能
•   1.3 肽聚糖合成酶复合体PBP1a/LpoA与 PBP1b/LpoB
•     1.3.1 肽聚糖合成酶复合体的组成
•     1.3.2 肽聚糖合成酶复合体的生理功能差异
•   1.4 选题意义、研究内容及技术路线
•     1.4.1 选题意义
•     1.4.2 研究内容及技术路线
• 第二章 两个PBP1-Lpo复合体缺失突变株的生理表型差异
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 供试菌株、质粒和培养条件
•     2.2.2 实验试剂及配方
•     2.2.3 框内缺失突变株的构建
•     2.2.4 细胞形态观察
•     2.2.5 低渗环境（NaCl-less）、SDS和 VAN敏感性测定
•     2.2.6 NaCl敏感性测定
•     2.2.7 NPN摄取能力测定
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 PBP1a/LpoA缺失菌株的细胞形态受损
•     2.3.2 PBP1a/LpoA缺失菌株对渗透压敏感
•     2.3.3 PBP1a/LpoA缺失菌株对SDS敏感
•     2.3.4 PBP1a/LpoA缺失菌株的细胞外膜通透性增强
•   2.4 本章小结与讨论
• 第三章 PBP1b表达量上调功能补偿PBP1a
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 供试菌株、质粒和培养条件
•     3.2.2 试剂
•     3.2.3 基因回补菌株的构建
•     3.2.4 表型检测
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 低剂量诱导PBP1b使 PBP1a/LpoA缺失菌株表型回复
•     3.3.2 PBP1b过量表达对菌株有毒害作用
•     3.3.3 PBP1b发挥功能离不开其任一结构域
•     3.3.4 LpoB表达量的增加不能使PBP1a/LpoA缺失菌株表型回复
•   3.4 本章小结与讨论
• 第四章 利用转座子插入技术筛选PBP1a/LpoA缺失抑制子
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 供试菌株、质粒和培养条件
•     4.2.2 试剂
•     4.2.3 构建转座子随机突变体库
•     4.2.4 抑制子表型鉴定
•     4.2.5 AP-PCR
•     4.2.6 转座子插入位点的确定
•     4.2.7 基因缺失突变株以及回补菌株构建
•     4.2.8 检测启动子活性
•     4.2.9 荧光定量PCR
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 构建转座子突变体库
•     4.3.2 AP-PCR扩增转座子插入位点侧翼片段
•     4.3.3 转座子插入位点的鉴定
•     4.3.4 hrpB失活对PBP1a/LpoA缺失菌株表型缺陷无影响
•     4.3.5 hrpB抑制子中PBP1b表达量上调
•   4.4 本章小结与讨论
• 第五章 严谨饥饿蛋白SspA调控PBP1b的功能补偿
•   5.1 引言
•   5.2 材料与方法
•     5.2.1 供试菌株、质粒和培养条件
•     5.2.2 基因缺失突变株的构建
•     5.2.3 基因回补菌株的构建
•     5.2.4 荧光定量PCR
•     5.2.5 表型检测
•     5.2.6 凝胶迁移实验
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 sspA失活抑制PBP1a/LpoA缺失菌株表型缺陷
•     5.3.2 sspA失活使PBP1b表达量增强
•     5.3.3 SspA非直接调控mrcB
•     5.3.4 SspA通过调控H-NS参与PBP1b的功能补偿
•     5.3.5 σ因子RpoS对 PBP1a/LpoA缺失菌株表型无影响
•   5.4 本章小结与讨论
• 第六章 总结与展望
•   6.1 总结
•   6.2 创新之处
•   6.3 不足与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
•   1 作者简历
•   2 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 学位论文数据集

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蔡静晓

导师: 余志良,音建华

关键词: 肽聚糖合成酶,严谨饥饿蛋白

来源: 浙江工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江工业大学

基金: 国家自然科学基金

分类号: Q936

DOI: 10.27463/d.cnki.gzgyu.2019.000546

总页数: 83

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