白桦SPL3,9,10基因克隆及功能鉴定

论文摘要

白桦（Betula platyphylla Suk.）是中国北方重要的林木树种之一,单性花,雌雄同株,具有重要的研究价值。SPL（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE）转录因子是植物特有的基因家族,广泛存在于绿色植物中,它在调控叶片发育、花和果实发育、育性等方面起重要作用。本实验首先通过基因组数据库的信息,从白桦中克隆到BpSPL3、BpSPL9和BpSPL10基因的ORF序列,并构建相应过表达载体和抑制表达载体,分别命名为:35::BpSPL3-GFP、35S::BpSPL9-GFP、35S::BpSPL10-GFP、35S::BpSPL3-RNAi、35S::BpSPL9-RNAi 和 35S::BpSPL10-RNAi。同时通过双酶切的方法克隆出起始密码子上游2000bp的启动子序列并构建带有GUS标签的表达载体,依次命名为 BpSPL3::GUS,BpSPL9::GUS,BpSPL10::GUS。对BpSPL3、BpSPL9和BpSPL10基因的启动子进行顺式作用元件预测,发现上述基因的启动子序列除含有核心启动子元件外,还含有光响应作用元件,激素类相应元件,非生物胁迫类响应元件等。通过农杆菌介导的方法将BpSPL3::GUS表达载体瞬时转化至白桦以及蘸花法稳定遗传转化至拟南芥中,结果显示BpSPL3启动子在白桦中的叶片毛状体、茎、芽和根上有高度表达;在拟南芥中的新叶毛状体、老叶的叶边缘处、侧根和雌蕊柱头中有较高的GUS表达活性。通过亚细胞定位的方法发现BpSPL3基因特异性定位于细胞核中。农杆菌介导的方法遗传转化获得BpSPL3基因的转基因株系。通过对的转基因株系分析发现BpSPL3过表达转基因植株根长变短,莲座叶数量显著减少,初级茎数量增加,角果长度及数量减少,同时发现过表达BpSPL3转基因株系四轮花器官均显著减小。实时荧光定量分析PNY、LFY、LBD10和LBD27基因在转基因植株花序中的表达量水平,结果显示表达量均提高2-4倍不等。表明在过表达BpSPL3转基因拟南芥中,PNY、LFY、LBD10和LBD27基因可能直接或间接参与花发育,并受BpSPL3基因的调节。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 白桦的研究进展
•   1.2 SPL转录因子研究进展
•   1.3 研究目的和意义
•   1.4 研究的技术路线
• 2 白桦SPL3,9,10基因及其启动子克隆
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株与载体
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 药品配置
•     2.1.5 实验室仪器设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 RNA的提取及cDNA第一链的合成
•     2.2.2 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10基因克隆
•     2.2.3 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10基因过表达载体构建
•     2.2.4 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10基因抑制表达载体构建
•     2.2.5 农杆菌转化
•     2.2.6 生物信息学分析
•     2.2.7 白桦组培苗DNA的提取
•     2.2.8 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10启动子克隆及表达载体构建
•     2.2.9 启动子顺式作用元件预测
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10基因克隆
•     2.3.2 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10基因生物信息学分析
•     2.3.3 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10基因过表达载体构建
•     2.3.4 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10基因抑制表达载体构建
•     2.3.5 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10启动子克隆及表达载体的构建
•     2.3.6 BpSPL3,BpSPL9,BpSPL10启动子顺式作用元件预测
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 3 BpSPL3基因功能鉴定
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 菌株与载体
•     3.1.3 实验试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 亚细胞定位
•     3.2.2 蘸花法侵染拟南芥
•     3.2.3 瞬时侵染白桦
•     3.2.4 GUS组织化学染色分析
•     3.2.5 转基因植株的筛选及鉴定
•     3.2.6 转基因植株的形态学观察及统计学分析
•     3.2.7 qRT-PCR分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 BpSPL3基因启动子转录活性分析
•     3.3.2 BpSPL3基因亚细胞定位
•     3.3.3 BpSPL3转基因拟南芥的获得及检测
•     3.3.4 BpSPL3转基因拟南芥表型分析
•     3.3.5 BpSPL3转基因花发育相关基因表达分析
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 田晶

导师: 刘雪梅

关键词: 白桦,转基因,启动子,花发育

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,林业

单位: 东北林业大学

基金: 中央高校基本科研业务费专项基金E类项目(2572015EA05)

分类号: Q943.2;S792.153

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000771

总页数: 54

文件大小: 5959K

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