辅因子NADPH调控谷氨酸棒杆菌合成L-赖氨酸时胞内微环境的生理机制

论文摘要

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）在维持谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）细胞生长和L-赖氨酸合成中起重要作用。该文通过敲除参与C.glutamicum胞内NADPH合成途径中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和苹果酸酶基因malE,并将自身NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因icdCg替换为变形链球菌（Streptococcus mutans）NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶基因icdSm,构建一株阻断胞内NADPH合成的工程菌株C.glutamicum LYS?zwf?malE?icdCg::icdSm。并比较分析阻断胞内NADPH合成对菌体生长、葡萄糖代谢和L-赖氨酸合成的影响。通过添加不同浓度的NADPH溶液以确定维持细胞L-赖氨酸合成能力最适NADPH阈值范围,并分析胞内微环境参数的变化规律,从而初步解析胞内辅因子NADPH水平调控胞内微环境的生理机制。主要研究结果如下:（1）重组菌胞内NADPH含量降低至0.15μmol·（g DCW）-1,明显低于出发菌1.43μmol·（g DCW）-1,同时胞内NADH含量由出发菌1.97μmol·（g DCW）-1提高至2.73μmol·（g DCW）-1,实现了异柠檬酸脱氢酶辅酶依赖型的转变。ATP含量降低13.10%,而ADP和AMP含量均有所升高。摇瓶发酵结果表明,重组菌葡萄糖代谢能力明显减弱,生长也相对缓慢,菌体生物量降低4.36%。同时L-赖氨酸产量降低87.69%,而在胞内积累了大量副产物,如丙酮酸、乳酸等。（2）培养基中添加不同终浓度NADPH溶液考察其对L-赖氨酸生产强度的影响。与未添加NADPH相比,当NADPH终浓度为0.2 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2mmol·L-1和4 mmol·L-1时菌体生物量分别提高7.98%、11.77%、22.28%、15.86%和6.52%,L-赖氨酸产量分别提高1.16倍、4.87倍、9.59倍、11.54倍和7.61倍,而L-赖氨酸生产强度分别提高0.08倍、3.36倍、6.84倍、8.96倍和6.14倍。实验结果表明在培养基中添加一定量辅因子NADPH时,菌体生长、L-赖氨酸产量及其生产强度均得到了一定恢复,当过量添加时其促进作用均明显减弱。伴随着NADPH含量的提高,L-赖氨酸生产强度呈现出先逐渐增强后逐渐减弱的趋势。（3）对不同NADPH阈值浓度0 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、2 mmol·L-1和4 mmol·L-1下胞内能量辅因子（AMP,ADP,ATP）、氧化还原辅因子（NAD+,NADH,NADP+,NADPH）、乙酰-CoA和活性氧簇（ROS）进行定量分析和差异比较,并初步解析了胞内辅因子NADPH水平调控胞内微环境的生理机制。当NADPH阈值浓度为0 mmol·L-1、0.5mmol·L-1、2、4 mmol·L-1时胞内NADPH水平分别为0.15μmol（g DCW）-1、0.24μmol（g DCW）-1、1.83μmol（g DCW）-1和2.65μmol（g DCW）-1,ATP水平分别为4.21μmol（g DCW）-1、4.32μmol（g DCW）-1、4.48μmol（g DCW）-1、4.67μmol（g DCW）-1,胞内ROS水平分别提高1.35%、1.79%和15.21%。实验结果表明,当NADPH阈值浓度低于2 mmol·L-1时,阈值浓度的提高可以有效提高胞内NADPH、ATP水平和L-赖氨酸生产强度,降低胞内NADH水平,增强乙酰-COA供给并强化中心碳代谢途径。然而当NADPH阈值浓度超过2 mmol·L-1时,阈值浓度的提高使得L-赖氨酸生产强度逐渐降低,同时胞内NADH水平提高并伴随着乙酰-CoA减少,中心碳代谢弱化。此外,在高NADPH阈值浓度下活性氧簇（ROS）增强,而过高的ROS水平引起细胞氧化应激反应,最终导致细胞凋亡,菌体生物量减少。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 NADPH概述
•     1.1.1 NADPH及其理化性质
•     1.1.2 NADPH的生理意义
•   1.2 辅因子NADPH的代谢途径
•     1.2.1 NADPH的常规合成途径
•     1.2.2 NAD激酶途径
•     1.2.3 吡啶核苷酸转氢酶途径
•     1.2.4 乙醛脱氢酶途径
•   1.3 胞内NADPH水平与目标代谢产物的关系
•     1.3.1 胞内NADPH水平影响底物的转化效率
•     1.3.2 胞内NADPH水平影响目标代谢产物生产强度
•     1.3.3 胞内NADPH水平影响菌体对底物的利用范围
•     1.3.4 胞内NADPH水平影响目标代谢产物产量
•   1.4 NADPH调控胞内微环境的研究现状
•   1.5 本课题的研究意义和主要研究内容
•     1.5.1 本课题的研究意义
•     1.5.2 本课题的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株、质粒与引物
•     2.1.2 主要实验仪器
•     2.1.3 主要实验试剂
•     2.1.4 培养基及培养条件
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 谷氨酸棒杆菌基因组DNA提取
•     2.2.2 质粒的提取
•     2.2.3 PCR扩增反应
•     2.2.4 PCR产物胶回收与纯化
•     2.2.5 酶切反应
•     2.2.6 去磷酸化反应
•     2.2.7 酶连反应
•     2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备及其化学转化法
•     2.2.9 谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备及其电转化法
•     2.2.10 重组自杀型敲除质粒的构建
•     2.2.11 重组菌株的构建
•   2.3 分析方法
•     2.3.1 菌体生长情况的分析
•     2.3.2 葡萄糖含量及L-赖氨酸浓度的测定
•     2.3.3 其他氨基酸浓度的测定
•     2.3.4 有机酸含量的测定
•     2.3.5 胞内NADP（H）的测定
•     2.3.6 胞内NAD（H）的测定
•     2.3.7 胞内ATP、ADP、AMP的测定
•     2.3.8 胞内乙酰-CoA含量的测定
•     2.3.9 胞内ROS的测定
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 阻断胞内NADPH合成的工程菌株构建
•     3.1.1 基因敲除载体pK18mobsacB-?zwf、p K18mobsacB-?malE的构建
•     3.1.2 基因置换载体pK18mobsacB-?icd Cg::icd Sm的构建
•     3.1.3 重组菌C.glutamicum LYS?zwf?malE?icd Cg::icd Sm的构建
•   3.2 阻断胞内NADPH合成途径对菌体生长及代谢的影响
•     3.2.1 重组菌胞内腺嘌呤核苷酸、吡啶核苷酸的变化
•     3.2.2 阻断胞内NADPH合成途径对葡萄糖消耗速率和菌体生长的影响
•     3.2.3 阻断胞内NADPH合成途径对L-赖氨酸合成的影响
•     3.2.4 阻断胞内NADPH合成途径对副产物合成的影响
•   3.3 确定维持细胞L-赖氨酸合成能力的最适NADPH阈值范围
•     3.3.1 不同NADPH浓度对重组菌生长的影响
•     3.3.2 不同NADPH浓度对重组菌L-赖氨酸生产强度的影响
•   3.4 初步解析胞内辅因子NADPH水平调控胞内微环境生理机制
•     3.4.1 不同阈值浓度下重组菌胞内吡啶核苷酸的检测分析
•     3.4.2 不同阈值浓度下重组菌胞内腺嘌呤核苷酸的检测分析
•     3.4.3 不同阈值浓度下重组菌胞内乙酰-CoA的检测分析
•     3.4.4 不同阈值浓度下重组菌胞内ROS的检测分析
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A:Streptococcus mutans JH1005 NAD+-icd Sm基因序列
• 附录 B:作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨汉昆

导师: 张伟国

关键词: 阈值范围,赖氨酸,微环境

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ922.3;Q78

总页数: 54

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