（黑龙江省中医药科学院）
摘要：目的本课题通过建立系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）大鼠模型，初步探讨养阴止血方的作用机理。方法将50只Wistar大鼠。随机分为空白对照组、模型对照组、养阴止血方低、中、高剂量组，复制大鼠MsPGN模型，检测尿沉渣中红细胞计数，光镜下观察肾脏组织形态学改变，免疫组化法检测肾脏组织中Bcl-2基因的表达水平。结果养阴止血方能够减少MsPGN大鼠尿红细胞，与模型对照组比较均有显著差异（p<0.05）；且随着时间的延长疗效增强；模型对照组Bcl-2基因阳性表达明显增强；养阴止血方高、中、低治疗组阳性表达明显减弱，与剂量大小无明显相关性。结论养阴止血方能够减少MsPGN大鼠尿红细胞，改善模型大鼠肾脏组织病理损害，抑制MsPGN大鼠Bcl-2基因的表达。
肾小球系膜细胞异常增殖是多种肾小球疾病共同的病理改变特征。肾小球损伤时，肾小球系膜细胞（GMCs）是最易被激活的肾脏固有细胞，活化的GMCs可发生明显的增殖，并释放多种炎症介质，促进细胞外基质积聚，从而形成恶性循环，加剧肾小球损伤，发生硬化乃至肾功衰[1]。增生的系膜细胞可通过凋亡来清除，在系膜细胞凋亡的调控因素中，Bcl-2基因日前最受关注，其突出作用是抑制细胞凋亡；研究发现肾小球系膜细胞上有Bcl-2基因的表达，提示其可能在系膜细胞凋亡中起作用[2]。养阴止血方是由《重楼玉钥》中养阴清肺汤化裁而来，以“清热解毒、滋阴凉血化瘀”为治则，既往研究该方能调节过敏性紫癜患者免疫失衡，减少患者尿沉渣中红细胞计数。本文探讨其对于MsPGN干预作用的机制，现报道如下：
1.实验材料
1.1实验动物
清洁级雄性健康4～6周的wistar大鼠50只，体重在150～200g之间，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司（SCXK（吉）-2011-0004）。适应性饲养1周后，查尿红细胞和尿检蛋白都为阴性。随机分为4组，分别为空白对照组、模型对照组、养阴止血方低、中、高剂量组，每组10只；用苦味酸分别染色标记各只大鼠。自正式实验的第一天起经口灌服牛血清白蛋白（BSA）400mg/kg（4ml/kg）隔日一次，用蒸馏水配制BSA，灌胃直至第8周；于实验第1天经皮下分点注射完全弗氏佐剂0.2ml（含BSA2mg），第8天经皮下分点注射不完全弗氏佐剂0.2ml（含BSA2mg）。于实验第8天和第15天，分别从尾静脉注射SEB0.4mg/kg体重（配成无菌生理盐水溶液）各1次。
空白对照组经口灌服蒸馏水，每日一次，每次2ml/100g，持续14周。模型对照组于第9周后开始蒸馏水每日灌胃，每次2ml/100g，至实验结束。养阴止血方低、中、高剂量组按2ml/100g/日于造模第9周出现蛋白尿时开始给药，至实验结束。
1.2实验药物：
养阴止血方，由生地、赤芍、玄参、麦冬、丹皮、连翘、板蓝根、白茅根、茜草、藕节、海螵蛸等组成。由黑龙江省中医药科学院制剂室配制，分别浓煎成0.85g/ml，1.69g/ml，338g/ml.
2.标本采集
2.1分别于实验第8，14周各检测1次尿沉渣红细胞计数。
2.2实验第14周断颈处死大鼠，剖取双肾，在冰板上将肾纵向切开成4等份，一份切取皮质部分，装入冰存管内，放入液氮罐中，备用；两份立即投入4%多聚甲醛（1/1000DEPC）固定2小时，梯度酒精脱水（50%～100%），二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡切片厚度3μm，裱于用防脱片剂处理过的载玻片上，而后置60℃恒温箱中烤片，24h后置4℃冰箱保存，以备免疫组化检测；余下一份肾，也切取皮质部分，放入甲醛中以备光镜检测。
3.实验指标检测
3.1大鼠尿沉渣红细胞计数检测
分别于实验第8，11，14周各检测1次，分别把大鼠放置于金属代谢笼内，留取4小时尿液，每只大鼠收集尿液前分别灌服蒸馏水5ml。
3.2大鼠肾组织形态学检测
3.3免疫组织化学染色方法检测Bcl-2基因表达
免疫组化定量分析光镜下观察，每张图片随机选取5个视野；利用免疫组化定量分析软件Image-ProPlus6.0进行灰度值测定，结果用灰度值表示其表达强度，灰度值越高表达越低。
4.统计学处理
实验结果采用SPSS18.0forWindows统计软件进行统计分析。计量资料用（均数±标准差）表示；多组间比较用单因素方差分析的LSD法进行多重比较；以p＜0.05为具有统计学意义。
5.结果：
5.1对尿中红细胞的影响
表1显示：从第8周开始，大鼠尿中红细胞明显增多，提示造模成功，第11周开始养阴止血方高、中、低剂量治疗组红细胞减少与模型对照组比较差异显著（p<0.05）；第14周养阴止血方各剂量组红细胞明显减少，与模型对照组比较均有显著差异（p<0.05），说明养阴止血方有明显的减少血尿的作用，且随着时间的延长疗效增强，中剂量组疗效最佳。
表1各组大鼠第8，11，14周末尿红细胞的变化（x±s，个/HP）
注：与空白组比较▲P<0.05，与模型组比较◆P<0.05
5.2肾脏组织形态学改变
光镜下正常空白对照组肾小球形态均称一致，形状如常，毛细血管球及肾小囊结构清晰未见异常，无系膜基质与系膜细胞增生；肾间质无炎症细胞浸润，无水肿；肾小管上皮细胞无坏死变性等病理改变。模型对照组肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，肾间质可见炎细胞浸润，肾小管上皮细胞空泡及颗粒样变性，提示造模成功。养阴止血方各治疗组：病理损害较模型组轻，肾小球系膜可见局灶、节段系膜细胞增生，肾间质未见炎细胞浸润，肾小管可见轻度空泡及颗粒样变性。
5.3.1MsPGN大鼠肾脏组织中Bcl-2的表达（见图1-图5）
实验结果表明，Bcl-2阳性反应物为棕黄色颗粒。空白对照组肾小球中有极微弱的表达。模型对照组Bcl-2阳性表达增强，阳性颗粒现于肾小球系膜区及肾小管上皮细胞。与空白对照组相比，各组大鼠肾组织中Bcl-2表达均明显增高；与模型对照组相比，养阴止血方各治疗组大鼠肾组织中Bcl-2表达均明显降低。
5.3.2MsPGN大鼠肾组织中Bcl-2表达定量
表2各组大鼠Bcl-2表达（±s）
图3：养阴止血方中剂量组×400HE图4：养阴止血方高剂量组×400HE
图5：养阴止血方低剂量组×400HE
讨论：
系膜细胞增殖是多种肾脏疾病的核心病理环节，对肾小球损伤的进展具有重要意义。有研究表明，MsPGN发病可能与增殖的系膜细胞凋亡率下降有关。Bcl-2是研究得最早也最充分的凋亡相关基因。它是一种膜整合蛋白，广泛存在于核膜、内质网膜、线粒体上，可以预防多种原因引起的细胞凋亡，属于抑制凋亡的基因，它的高度表达能阻断细胞凋亡的发生[3]。当Bcl-2基因表达上调时，细胞凋亡就会延缓；当Bcl-2基因表达下调时，细胞会发生凋亡。近期研究证实部分药物可通过影响凋亡调控基因表达诱导肾脏细胞凋亡，延缓MsPGN进程[4]。本实验结果表明，模型组尿红细胞从第8周到14周逐步增多，说明MsPGN大鼠病情随着时间的延长逐渐加重，无自愈倾向；与模型组相比，养阴止血方各治疗组大鼠尿中红细胞明显减少；免疫组化结果显示，肾小球系膜区凋亡基因bcl-2的表达下降，这可能是养阴止血方从细胞因子和细胞凋亡两方面抑制系膜细胞增生和系膜基质积聚，改善肾脏病理变化，从而治疗MsPGN的有效环节之一。但MsPGN发病原因很多，病理机制复杂，凋亡异常仅是可能的病理环节之一，但是否还存在其他作用机制，有待于进一步探讨。
参考文献
[1]MitchellD，RodgersK，HanlyJ，etal.LipoxinsinhibitAkt/PKBactivationandcellcycleProgressioninhumanmesangialcells[J].AmericanjournalofPathology2004，64（3）：937一946
[2]BakerAJ，MooneyA，ughesJ，etal.Mesangialcellapoptosis；themajormechanismforresolutionofglomeralarhypercellularityinexperimentalmesangialproliferativehephitis，JClinInvest，1994，94；2105-2166.
[3]王礼凤，刘莉君，孙守才，李长秦，宋健，郑旭锐；姜黄素对肝纤维化大鼠肝组织Bcl-2及Bax表达的影响[J]；《实用中医药杂志》2011年04期.
[4]柴华旗，江黎明，陈孝文.尼卡地平对大鼠Thy1系膜增生性肾小球肾炎的作用及其对肾内bcl-2/bax表达的影响.中国中西医结合肾病杂志，2001，2（4）：203-206.
注：黑龙江省青年科学基金项目：编号：QC2011C113