裂殖酵母热激蛋白Hsp90促进多个基因沉默复合物组装参与异染色质形成

论文摘要

真核细胞的染色质可以分为常染色质和异染色质。己有的研究表明,异染色质在调控基因表达、维持基因组稳定性、细胞的发育分化以及肿瘤的表观调控等方面发挥着重要作用。至今,异染色质的形成及其功能一直没有完全研究清楚。已有的研究已经比较清楚地表明,裂殖酵母利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）机制在细胞核中染色质水平上直接介导异染色质的形成。Hsp90作为分子伴侣蛋白家族的一个特殊成员。它不仅参与蛋白的正确折叠维持蛋白稳态,而且参与许多重要的生物进程。近期的研究表明,在高等生物中热激蛋白90（heat shock protein 90,Hsp90）参与RNA诱导沉默复合物复合物（RISC）的组装从而影响RNAi介导的基因沉默。我们实验室前期研究发现,裂殖酵母中Hsp90突变体swol-26可以不同程度地解除插入在近着丝粒区、交配型区和rDNA区的报道基因的沉默。在此基础上,本研究的遗传学实验表明swol-26突变体可以使得在异位建立的RNAi介导的基因沉默产生缺陷,并且特异的破坏异染色质区的Hsp90导致近着丝粒区严重的基因沉默缺陷。通过生化实验,我们发现swol-26影响RNAi机制中RITS（RNA-induced transcriptional gene silencing）复合物以及其上游的 ARC（Argonaute chaperone complex）复合物的组装。同时,Hsp90与RITS复合物存在相互作用。进一步研究发现,Hsp90不仅通过RNAi机制调控异染色质形成,还直接影响基因转录沉默复合物SHREC（Snf2/Hdac Repressive Complex）的组装。我们的研究还发现,swol-26突变体可以解除小染色体端粒区的基因沉默,并且显著影响从酵母到人类中都保守的Shelterin端粒复合物的组分Pozl的蛋白水平,但却不影响Shelterin复合物的组装。进一步研究发现,swol-26突变体明显影响Shelterin对于CLRC以及SHREC复合物的招募。综上所述,我们的研究阐明了热激蛋白Hsp90调控多个基因沉默复合物参与异染色质形成。同时,我们首次发现Shelterin作为Hsp90的底物,这在髙等真核生物包括人类细胞中可能也是保守的。

论文目录

• 缩写词表
• 摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
•   1 裂殖酵母中异染色质区
•   2 RNAi与异染色质形成
•     2.1 小干扰RNA的生成
•     2.2 siRNA的代谢
•     2.3 包含Ago1的基因沉默复合物
•     2.4 RNAi正循环
•     2.5 异染色质蛋白与异染色质的形成
•     2.6 RNAi介导亚端粒区异染色质的形成
•     2.7 Shelterin复合物介导近端粒区异染色质的形成
•   3 热激蛋白HsP90
•     3.1 人类细胞Hsp90
•     3.2 Hsp90参与RNAi
•   4 本论文的研究目的、内容和意义
• 第二章 材料和方法
•   1 材料
•     1.1 大肠杆菌
•     1.2 酵母菌株
•     1.3 质粒
•     1.4 引物
•     1.5 分子生物学工具酶
•     1.6 主要试剂及耗材
•     1.7 主要仪器及设备
•     1.8 常用培养基以及主要缓冲液的配制
•   2 方法
•     2.1 裂殖酵母菌株的构建
•     2.2 裂殖酵母基因组的粗提取—硅酸锆珠破碎法
•     2.3 裂殖酵母的转化
•     2.4 质粒DNA的提取
•     2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
•     2.6 质粒DNA的细菌转化
•     2.7 常规PCR
•     2.8 定点诱变PCR
•     2.9 T-type构建质粒
•     2.10 梯度稀释实验（Drop test）
•     2.11 免疫印迹检测（Western blot）
•     2.12 免疫共沉淀（Co-IP）
•     2.13 MBP-Hsp90（TEV sites）大肠杆菌的诱导表达及纯化
•     2.14 TEV体外酶切实验
•     2.15 转盘激光共聚焦显微镜使用
•     2.16 RT-PCR
• 第三章 实验结果和分析
•   1 特异破坏近着丝粒区的HSP90导致基因沉默的严重缺陷
•   2 Hsp90调控含有Argonaute蛋白的基因沉默复合物的组装
•   3 Hsp90与RITS复合物存在相互作用
•   4 Hsp90调控SHREC复合物的组装参与异染色质基因沉默
•   5 Hsp90调控Shelterin复合物的组装参与亚端粒区异染色质基因沉默
•   6 Hsp90影响Shelterin复合物招募CLRC和SHREC复合物到亚端粒异染色质区
•   7 epe1⊿和mst2⊿缺失突变可以逆转swo1-26突变体中的基因沉默的缺陷
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙力

导师: 靳全文

关键词: 裂殖酵母,异染色质,基因沉默

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q78

总页数: 79

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