c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

论文摘要

为构建c-Jun氨基末端激酶3 (c-Jun N-terminal kinase3,JNK3)的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环(activation-loop,A-loop)结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾(human emborynic kidney,HEK) 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 (A-loop)结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 (A-loop)成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。

论文目录

  • 1 实验材料
  •   1.1 质粒和细胞
  •   1.2 主要试剂和工具酶
  • 2 实验方法
  •   2.1 A-loop结构域突变型表达质粒的突变位点信息的选择
  •   2.2 JNK3(A-loop)基因引物序列的设计与合成
  •   2.3 PCR扩增目的基因
  •   2.4 质粒构建与鉴定
  •   2.5 重组质粒的转染
  • 3 结果与分析
  •   3.1 A-loop突变型JNK3基因的PCR扩增及电泳分析
  •   3.2 真核表达质粒p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)的双酶切鉴定
  •   3.3 真核表达质粒p VP16-eGFP-Myc-JNK3(A-loop)的测序分析
  •   3.4 真核表达质粒p VP16-e GFP-Myc-JNK3(A-loop)转染HEK293T细胞
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 文章来源

    类型: 期刊论文

    作者: 王帝,李振玲,宋远见,刘志安

    关键词: 氨基末端激酶,活化环,真核表达质粒,结构域,突变

    来源: 科学技术与工程 2019年26期

    年度: 2019

    分类: 工程科技Ⅱ辑,基础科学

    专业: 生物学

    单位: 徐州医科大学基础医学院

    基金: 国家自然科学基金(81671208)资助

    分类号: Q78

    页码: 118-123

    总页数: 6

    文件大小: 8011K

    下载量: 45

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