c-Jun氨基末端激酶3结构域突变质粒的构建、鉴定与转染

论文摘要

为构建c-Jun氨基末端激酶3 （c-Jun N-terminal kinase3,JNK3）的p VP16-eGFP-Myc-JNK3活化环（activation-loop,A-loop）结构域突变型重组质粒,通过A-loop突变型JNK3的c DNA序列以及p VP16-eGFP-Myc的酶切位点设计引物,PCR扩增目的基因,使用限制性内切酶Mlu I与Xba I将基因克隆到p VP16-eGFP-Myc真核表达载体中,构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3（A-loop）结构域突变型重组质粒。转化后,通过双酶切鉴定与DNA测序判断是否成功构建重组质粒,使用Trans IntroTMEL Transfection Reagent转染人胚肾（human emborynic kidney,HEK） 293T细胞,通过荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况。结果表明:构建p VP16-eGFP-Myc-JNK3 （A-loop）结构域突变型重组质粒,双酶切鉴定和测序结果显示构建成功; p VP16-eGFP-MycJNK3 （A-loop）成功转染HEK293T细胞且表达。鼠源JNK3结构域突变型质粒构建成功,对进一步研究JNK3结构域在相关疾病的作用和机制提供实验工具。

论文目录

• 1 实验材料
•   1.1 质粒和细胞
•   1.2 主要试剂和工具酶
• 2 实验方法
•   2.1 A-loop结构域突变型表达质粒的突变位点信息的选择
•   2.2 JNK3（A-loop）基因引物序列的设计与合成
•   2.3 PCR扩增目的基因
•   2.4 质粒构建与鉴定
•   2.5 重组质粒的转染
• 3 结果与分析
•   3.1 A-loop突变型JNK3基因的PCR扩增及电泳分析
•   3.2 真核表达质粒p VP16-eGFP-Myc-JNK3（A-loop）的双酶切鉴定
•   3.3 真核表达质粒p VP16-eGFP-Myc-JNK3（A-loop）的测序分析
•   3.4 真核表达质粒p VP16-e GFP-Myc-JNK3（A-loop）转染HEK293T细胞
• 4 讨论
• 5 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王帝,李振玲,宋远见,刘志安

关键词: 氨基末端激酶,活化环,真核表达质粒,结构域,突变

来源: 科学技术与工程 2019年26期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅱ辑,基础科学

专业: 生物学

单位: 徐州医科大学基础医学院

基金: 国家自然科学基金(81671208)资助

分类号: Q78

页码: 118-123

总页数: 6

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