基于病毒—宿主互作转录组解析STAU2促禽流感病毒复制作用机理

论文摘要

H5N1禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）属于高致病性流感病毒,且具有人畜共患的特点,对家禽生产和公共卫生安全造成严重威胁。本研究利用Dual RNA-seq技术,研究AIV感染鸡胚胎成纤维细胞（DF1）过程中病毒与宿主基因表达的动态调控。主要结论如下:1.AIV感染鸡DF1细胞0 h、6 h、12 h和20 h后,不同病毒基因的表达水平不同但均呈不断升高趋势,其中聚合酶基因PA、PB1和PB2的表达水平低于HA、NA等其他病毒基因的表达水平;本研究共鉴定到对照组与感染组之间、以及不同感染时间组别之间差异表达宿主基因2762个;2.差异表达基因信号通路富集分析结果显示,在病毒感染过程中,Cytokine-cytokine receptor interaction和Inflammation mediated by chemokine and cytokine signaling pathway在不同感染时间的差异表达基因中均被显著富集,说明细胞因子和趋化因子及其相关信号通路在病毒感染过程中发挥重要作用;3.将互作转录组结果与实验室前期开展的禽流感病毒-鸡宿主蛋白互作组结果联合分析,发现病毒感染所致的差异表达基因中,有130个基因和病毒蛋白存在相互作用,其中包括CCT5、CSE1L等已知的影响病毒复制的重要宿主基因,这些基因既和禽流感病毒蛋白有相互作用,同时表达水平又受AIV感染影响,提示这些基因可能是影响病毒感染及复制的重要候选基因;4.STAU2基因在病毒感染后基因表达水平呈现显著下调,该基因的主要作用是促进mRNA在不同细胞器的定位和转运,本研究以该基因为候选基因开展深入的机制研究。免疫共沉淀结果显示,STAU2蛋白与AIV的NS1蛋白存在相互作用。免疫荧光结果显示,二者在细胞质中呈现明显的共定位;敲降STAU2基因的表达后,人工感染AIV后发现敲降STAU2基因可显著降低病毒滴度,表明STAU2是禽流感病毒在鸡细胞中感染并复制所需要的宿主因子;对病毒感染后的宿主细胞进行核质分离并利用实时荧光定量PCR检测NS1 mRNA在细胞核与细胞质中的分布,结果显示,细胞总RNA中,NS1 mRNA水平在STAU2敲降组与对照组中无显著差异,而STAU2敲降组细胞质中NS1 mRNA水平显著低于对照组,STAU2敲降组细胞核中NS1 mRNA水平显著高于对照组,上述结果说明病毒感染过程中STAU2在不影响病毒NS1基因的转录的前提下影响了NS1 mRNA在核质中的分布,即STAU2可能促进NS1 mRNA由细胞核到细胞质的转运。敲降STAU2后细胞凋亡水平显著上调,据此推测在病毒感染过程中STAU2也可能通过抑制细胞凋亡进而促进AIV的复制。综上所述,本研究通过Dual RNA-seq技术探究了H5N1 AIV感染鸡细胞后病毒和宿主基因的动态变化,鉴定到促禽流感病毒基因STAU2,解析其通过促进病毒NS1 mRNA出核及抗细胞凋亡的方式促进禽流感病毒复制的作用机制。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 流感病毒的病原特性
•     1.1.1 流感病毒的结构
•     1.1.2 流感病毒的复制过程
•     1.1.3 流感病毒跨种传播
•   1.2 流感病毒的蛋白组成及功能
•     1.2.1 非结构蛋白NS
•     1.2.2 非结构蛋白NS
•     1.2.3 基质蛋白M
•     1.2.4 基质蛋白M
•     1.2.5 核蛋白NP
•     1.2.6 PB1 Frame2（PB1-F2）
•     1.2.7 聚合酶复合物（PA、PB1、PB2）
•   1.3 病原-宿主互作转录组研究
•     1.3.1 互作转录组
•     1.3.2 病原-宿主转录组研究进展
•     1.3.3 Dual RNA-seq的方法和应用
•   1.4 抗禽流感鸡的培育
•   1.5 本试验的目的与意义
•   1.6 技术路线
• 第二章 禽流感病毒-鸡宿主互作转录组研究
•   2.1 试验材料与方法
•     2.1.1 试验材料
•     2.1.2 主要仪器和试验配置
•     2.1.3 试验方法
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 DF1 细胞攻毒后的表型状态
•     2.2.2 RNA提取及质量检测
•     2.2.3 互作转录组测序评估
•     2.2.4 病毒基因表达水平分析
•     2.2.5 禽流感病毒感染宿主基因表达水平分析
•     2.2.6 基因在不同组之间的基因集富集分析（GSEA）
•     2.2.7 禽流感病毒感染过程中表达显著差异的宿主互作基因
•     2.2.8 候选基因功能验证
•   2.3 讨论
•     2.3.1 禽流感病毒感染过程中的关键信号通路
•     2.3.2 宿主互作基因在病毒感染过程中的表达模式
•   2.4 本章结论
• 第三章 STAU2 促进禽流感病毒复制研究
•   3.1 试验材料与方法
•     3.1.1 试验材料
•     3.1.2 主要仪器和试验配置
•     3.1.3 试验方法
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 NS1和STAU2 蛋白表达载体的构建
•     3.2.2 免疫共沉淀验证NS1与STAU2 存在相互作用
•     3.2.3 激光共聚焦验证NS1与STAU2 细胞共定位
•     3.2.4 STAU2 siRNA干扰效率检测
•     3.2.5 细胞活性检测
•     3.2.6 STAU2 促进H5N1 禽流感病毒的复制效率
•     3.2.7 STAU2 提高病毒感染后宿主细胞的免疫反应
•     3.2.8 STAU2 促进H5N1 禽流感病毒NS1 mRNA的出核
•     3.2.9 STAU2 抗细胞凋亡作用
•     3.2.10 不同鸡品种间STAU2 基因多态性分析
•   3.3 讨论
•     3.3.1 Staufen双链RNA结合蛋白家族影响多种病毒的复制
•     3.3.2 细胞凋亡与病毒复制的相互影响
•     3.3.3 STAU2 转运NS1 mRNA的作用机制
•   3.4 本章结论
• 第四章 全文结论
•   4.1 全文结论
•   4.2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王巧

导师: 赵桂苹

关键词: 禽流感病毒,互作转录组

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.65

总页数: 105

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