D型流感病毒反向遗传系统的构建及其HE基因免疫原性的研究

论文摘要

D型流感病毒是新定义的流感病毒家族的一员,于2011年首次从疑似患流感的猪体内分离获得,自2014年以来在世界各地的牛体内被发现,其主要宿主包括猪、牛和其他小反刍动物等。此外血清学证据也证明了D型流感病毒具有感染人类的可能性。同时该病毒也被认为与牛的呼吸道疾病有着密切的关系。HEF蛋白是D型流感病毒表面唯一的糖蛋白,决定其感染特性。因此对D型流感病毒基因特性以及HEF蛋白免疫原性的研究为预防D型流感病毒起到了重要作用。本研究首次尝试构建了D型流感病毒的反向遗传操作平台,并且利用昆虫细胞杆状病毒系统构建了可以作为D型流感病毒有效诊断抗原的HEF蛋白重组杆状病毒,并利用DNA免疫小鼠获得了抗HEF蛋白血清。实验主要分为两大部分,第一部分是:应用A型流感病毒的十三质粒反向遗传系统的pHH21和pCAGGS载体,通过分子克隆等手段构建了D型流感病毒的十二质粒反向遗传操作平台;同时依据广泛应用于A型流感病毒的八质粒反向遗传系统的pBD载体,构建了D型流感病毒的七质粒反向遗传系统。分别将两套系统的重组质粒通过共转染到293T细胞中,并将质粒转染的293T细胞上清液对细胞以及豚鼠进行感染,通过Real-time RT-PCR方法以及电镜观察对拯救病毒进行鉴定。第二部分是:首先利用杆状病毒载体构建了重组HEF蛋白的杆状病毒系统,通过红细胞凝集试验以及Western Blotting试验鉴定HEF蛋白的免疫原性。同时应用pCAGGS载体构建了用于小鼠DNA免疫的高效表达HEF蛋白的重组质粒,并通过与CpG-ODN分子佐剂进行联合免疫获得了相应的抗HEF蛋白血清,并通过血凝抑制试验进行抗体效价的检测。研究结果:（1）成功地构建了D型流感病毒的十二和七质粒反向遗传系统;（2）通过七质粒反向遗传系统共转染293T细胞成功获得特异性病毒粒子;（3）拯救的病毒不能够感染A549、MDCK、ST细胞,可在豚鼠的上呼吸道中进行少量的复制拷贝,但感染效力较低;（4）成功地构建了可以作为D型流感病毒诊断抗原的重组杆状病毒;（5）通过质粒与CpG-ODN分子佐剂联合免疫小鼠制备了具有较高血凝抑制效价的抗HEF蛋白血清。

论文目录

• 英文缩写词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
•   1.1 D型流感病毒的概述
•   1.2 D型流感病毒的研究进展
•     1.2.1 D型流感病毒的发现与流行
•     1.2.2 D型流感病毒的基因组与编码蛋白
•     1.2.3 D型流感病毒的致病性与致病机制
•     1.2.4 D型流感病毒的诊断与预防
•   1.3 反向遗传学的研究
•     1.3.1 反向遗传学的背景
•     1.3.2 反向遗传学在流感病毒中的应用
•   1.4 昆虫杆状病毒表达系统的研究
•     1.4.1 昆虫杆状病毒表达系统的概述
•     1.4.2 昆虫杆状病毒表达系统在流感病毒中的应用
•   1.5 DNA疫苗的研究
•     1.5.1 DNA疫苗的概述
•     1.5.2 DNA疫苗在流感病毒中的应用
•   1.6 展望
• 第2章 D型流感病毒反向遗传系统的构建
•   2.1 材料
•     2.1.1 载体、细胞和实验动物
•     2.1.2 主要试剂与配制方法
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 方法
•     2.2.1 全基因合成与引物设计
•     2.2.2 D型流感病毒十二质粒反向遗传系统的构建及鉴定
•     2.2.3 D型流感病毒七质粒反向遗传系统的构建及鉴定
•     2.2.4 D型流感病毒的拯救
•     2.2.5 感染细胞和豚鼠实验
•     2.2.6 Real-Time RT-PCR检测
•     2.2.7 电镜观察
•   2.3 结果
•     2.3.1 D型流感病毒反向遗传系统的构建及鉴定
•     2.3.2 病毒的拯救与鉴定
•   2.4 讨论与小结
•     2.4.1 讨论
•     2.4.2 小结
• 第3章 D型流感病毒的HEF蛋白的表达与抗血清的制备
•   3.1 材料
•     3.1.1 载体、细胞、实验动物
•     3.1.2 主要试剂与配制方法
•     3.1.3 主要仪器
•   3.2 方法
•     3.2.1 引物的设计与合成
•     3.2.2 pFastBac1-HEF重组质粒的构建
•     3.2.3 Bacmid-HEF重组杆状病毒系统的制备
•     3.2.4 Bacmid-HEF重组杆状病毒的拯救
•     3.2.5 Bacmid-HEF重组杆状病毒的扩增与鉴定
•     3.2.6 HEF蛋白的表达
•     3.2.7 pCAGGS-HEF表达质粒的构建与瞬时表达
•     3.2.8 小鼠的DNA免疫
•     3.2.9 抗HEF蛋白血清的鉴定
•   3.3 结果
•     3.3.1 重组杆状病毒系统的构建与HEF蛋白的鉴定
•     3.3.2 抗HEF蛋白血清的制备
•   3.4 讨论与小结
•     3.4.1 讨论
•     3.4.2 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 夏青

导师: 何秀霞

关键词: 型流感病毒,反向遗传,昆虫杆状病毒系统,抗蛋白血清

来源: 长春理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学,基础医学

单位: 长春理工大学

分类号: R392;R373

总页数: 66

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