基于代谢工程提高大肠杆菌L—苏氨酸产量的研究

论文摘要

L-苏氨酸作为人体必需八种氨基酸之一,被广泛运用于食品、药品和饲料等领域。随着市场需求的日益扩大,开发一株高产L-苏氨酸的菌株变得十分必要。大肠杆菌（Escherichia coli）由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸产生菌基因改造的模式菌。本文以实验室保藏的苏氨酸生产菌株E.coli THR为出发菌株,通过代谢工程手段改造出苏氨酸高产菌E.coli THR8。随后对摇瓶发酵培养基、发酵条件、5 L发酵罐转速及补料进行优化,进一步提高了L-苏氨酸产量。主要研究结果如下:（1）增加通往L-苏氨酸合成的碳通量,同时抑制苏氨酸的胞内吸收,减少过量苏氨酸对关键酶的反馈抑制。利用FLP/FRT重组酶系统敲除天冬氨酸激酶III（lysC）、磷酸果糖激酶II（pfkB）和苏氨酸主要吸收蛋白（sstT）,分别构建E.coli THRΔlysC（即E.coli THR1）、E.coli THRΔlysCΔpfkB（即E.coli THR2）和E.coli THRΔlysCΔpfkBΔsstT（即E.coli THR3）。L-苏氨酸产量较出发菌株分别提高0.55%、5.04%和9.97%,糖酸转化率除E.coli THR3增加了10.04%,其余分别下降14.78%和3.33%。（2）解除L-苏氨酸对天冬氨酸族氨基酸支路第一个关键酶的反馈抑制,增加产物合成后的胞外转运能力和辅因子NADPH供应。异源表达来自谷氨酸棒杆菌的解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysCfbr)、苏氨酸分泌转运蛋白（thrE）及丙酮丁醇梭菌中的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapC）,分别构建质粒并电转构建E.coli THRΔlysC/pEC-XK99E-lysCfbr（即E.coli THR4）、E.coli THRΔlysCΔpfkB/pEC-XK99E-lysCfbrthrE（即E.coli THR5）和E.coli THRΔlysCΔpfkBΔsstT/pEC-XK99E-lysCfbrthrEgapC（即E.coli THR6）。L-苏氨酸产量较出发菌株分别提高17.30%、32.71%和53.10%,糖酸转化率分别提高29.62%、24.79%和42.81%。其中E.coli THR6积累L-苏氨酸优势更明显。（3）增加天冬氨酸族氨基酸前体草酰乙酸（OAA）的供应。在基因组中插入谷氨酸棒杆菌中的丙酮酸羧化酶（pycA）,同时敲除由非必需基因gapA编码的NAD+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶。构建菌株E.coli THRΔlysCΔpfkBΔsstTΔgapA::pycA（即E.coli THR7）和E.coli THRΔlysCΔpfkBΔsstTΔgapA::pycA/pEC-XK99E-lysCfbrthrEgapC（即E.coli THR8）。L-苏氨酸产量较出发菌株分别提高17.21%和60.44%,糖酸转化率分别提高2.02%和44.03%。其中重组菌株E.coli THR8积累L-苏氨酸的产量提高到110.35 g·L-1,单位产酸能力提高到6.08 g·g-1 DCW,最大生物量为18.12 g DCW·L-1,菌体生长和产苏氨酸优势更明显。（4）对构建成功的E.coli THR8进行发酵培养基及发酵条件优化。设计单因素试验,而后利用Plackeet-Burman筛选得出对L-苏氨酸产量有显著影响的三个因素:玉米浆、葡萄糖和MgSO4·7H2O。另外,通过Box-Behnkne实验得出摇瓶发酵L-苏氨酸的最佳培养基配方(g·L-1):葡萄糖30.5、甜菜糖蜜14.0 mL·L-1、甜菜碱1.0、玉米浆0.75、H3PO4 0.6 mL·L-1、MgSO4·7H2O 0.80、FeSO4·7H2O 5.0×10-3、KCl 0.80、MnSO4·4H2O 1.0×10-2、CaCO3 20.0。在此基础上,对摇瓶发酵条件采用单因素实验优化,实验结果如下:发酵温度37°C,初始pH 7.0,装液量35 mL/500 mL,接种量12.5%,种子OD56262 0.4,发酵8 h添加终浓度为0.8 mmol·L-1 IPTG。在此优化条件下,摇瓶发酵L-苏氨酸产量为11.85 g·L-1,较优化前提高了15.61%。（5）在5 L发酵罐中对L-苏氨酸发酵过程中的转速及补料（葡萄糖）进行优化。菌体生长的不同阶段需要调节不同溶氧水平,另外,发酵液中残糖浓度也会影响L-苏氨酸的积累。维持残糖浓度5-10 g·L-1,最终L-苏氨酸产量达到118.98 g·L-1,较优化前提高7.8%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 L--苏氨酸概述
•     1.1.1 L-苏氨酸的理化性质及结构
•     1.1.2 L-苏氨酸的功能及用途
•   1.2 L--苏氨酸的生产方法
•     1.2.1 L-苏氨酸生产现状
•     1.2.2 L-苏氨酸生产方法
•   1.3 微生物发酵法生产L-苏氨酸
•     1.3.1 L-苏氨酸菌种选育
•     1.3.2 L-苏氨酸在E.coli中的生物合成及其代谢工程
•   1.4 研究意义和主要研究内容
•     1.4.1 研究意义
•     1.4.2 本课题的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株、质粒与引物
•     2.1.2 主要实验试剂
•   2.2 培养基及培养条件
•     2.2.1 培养基
•     2.2.2 菌体培养和发酵
•   2.3 分子实验方法
•     2.3.1 菌株基因组的提取方法
•     2.3.2 PCR扩增体系及反应程序
•     2.3.3 酶切与酶连反应
•     2.3.4 E.coli感受态细胞制备及转化方法
•     2.3.5 敲除菌株的构建
•     2.3.6 表达质粒的构建
•   2.4 分析方法
•     2.4.1 菌体浓度测定
•     2.4.2 葡萄糖测定
•     2.4.3 L--苏氨酸浓度测定
•     2.4.4 酶活性测定
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 苏氨酸合成途径中lysC、pfkB、sstT基因的敲除
•     3.1.1 E.coli THRΔlysC突变株的构建
•   3.2 苏氨酸代谢途径关键酶基因的过表达
•     3.2.1 C.glutamicum lysCfbr解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶基因lysCfbr测序分析
•     3.2.2 重组表达质粒的构建
•     3.2.3 外源目的基因的诱导表达及SDS-PAGE分析
•     3.2.4 异源表达蛋白的酶活性测定
•   3.3 多重基因修饰对L--苏氨酸发酵产量的影响
•   3.4 E.coli THR8 突变株的构建
•     3.4.1 ΔgapA::pycA片段的构建
•     3.4.2 重叠片段ΔgapA::pycA替换目的基因gapA
•     3.4.3 卡那霉素抗性基因片段及质粒pCP20的消除
•     3.4.4 pycA替换gapA对菌体生长的影响
•     3.4.5 pycA替换gapA对 E.coli THR6发酵L-苏氨酸的影响
•   3.5 发酵培养基组分优化
•     3.5.1 单因素实验
•     3.5.2 Plackeet-Burman设计及关键影响因素的确定
•     3.5.3 响应面法优化发酵培养基组成
•     3.5.4 验证试验
•   3.6 摇瓶发酵条件的优化
•   3.7 重组菌株E.coli THR8 5 L发酵罐发酵实验
•     3.7.1 不同搅拌转速对L-苏氨酸合成的影响
•     3.7.2 补料对L-苏氨酸合成的影响
•     3.7.3 补料分批发酵实验
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 魏佳

导师: 张伟国

关键词: 苏氨酸,大肠杆菌,辅因子,天冬氨酸激酶,发酵优化

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: Q78;TQ922

总页数: 59

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