基于稳定同位素标记衍生化结合液相色谱—质谱的多肽分析

论文摘要

稳定同位素标记衍生化与液相色谱-质谱联用已成为蛋白质和多肽类物质分析的重要技术。目前最为广泛应用的技术莫过于基于稳定同位素标记的一级质谱相对定量方法。本文内容包括对蛋白质组学的研究技术以及蛋白质组的相对定量分析方法进行简述,还对照多篇蛋白质组学研究现状的国内外文献。通过1-（5-氟-2,4-二硝基-苯基）-4-甲基哌嗪（PPZ）和碘甲烷的甲基化合成d0-MPPZ;d4-MPPZ;d8-MPPZ。我们开发的这种超过四重标记的衍生化试剂,通过结合使用液相色谱-串联质谱进行多种不同类别的多肽定量分析。该衍生化试剂每相邻两个轻/重标记的质量差相差4 Da,这是由不同的13C和D同位素标记而来。因衍生化试剂自带+1电荷,使得标记后的分析物在减轻电喷雾电离所固有的定量障碍,特别有利于抗电荷或低丰度的分析物。设计合成出的三种衍生化试剂通过使用核磁共振氢/碳谱和液相色谱-质谱联用等手段对其结构进行表征。因该衍生化试剂有反应活性大、离子化能力强和降低待测物最低检测限等优点,故结合高效液相色谱-质谱联用对多肽进行定量分析研究并优化了最佳衍生化条件和质谱参数。衍生化标记之后改变分析物的物理性质,显著改善极性物质的色谱性能,增强定量目标物的检测灵敏度。再使用一级质谱相对定量分析多肽时保证同位素标记在1:10到10:1的动态范围内成良好.的线性关系。同时在衍生化反应后,质谱数据中的衍生化产物峰与衍生化试剂的出峰顺序可以确定待测物中是否含有酪氨酸存在。并且该衍生化试剂还将待测物的最低检测限降低两个数量级以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 蛋白质组学
•   1.2 蛋白质组学研究技术
•     1.2.1 研究前景
•     1.2.2 蛋白质组学的质谱技术
•     1.2.3 定量蛋白质组学技术
•     1.2.4 稳定同位素标记技术
•   1.3 国内外研究现状
•   1.4 本课题的立题依据及研究意义
• 第二章 实验部分
•   2.1 引言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 试剂与仪器
•     2.2.2 衍生化试剂的合成及其表征
•       2.2.2.1 1-（5-氟-2,4-二硝基-苯基）-4-甲基哌嗪（PPZ）的合成
• 0-MPPZ的合成'>      2.2.2.2 d₀-MPPZ的合成
• 4-MPPZ的合成'>      2.2.2.3 d₄-MPPZ的合成
• 8-MPPZ的合成'>      2.2.2.4 d₈-MPPZ的合成
•   2.3 本章小结
• 第三章 稳定同位素标记衍生化-LC-MS分析多肽
•   3.1 引言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 仪器与试剂
•     3.2.2 样品溶液配制
•     3.2.3 衍生化反应
•     3.2.4 HPLC-UV检测条件
•     3.2.5 LC-MS 检测餅
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 MPPZ与多肽的衍生化反应条件优化
•       3.3.1.1 不同的缓冲体系对衍生化反应效率的影响
•       3.3.1.2 衍生化反应时间的优化
•       3.3.1.3 衍生化反应温度的优化
•       3.3.1.4 衍生化反应试剂与衍生化反应目标物的摩尔比优化
•     3.3.2 色谱条件的优化
•       3.3.2.1 最佳紫外波长的确定
•       3.3.2.2 色谱分析中固定相的选择
•       3.3.2.3 色谱分析中流动相体系的确定
•       3.3.2.4 最佳色谱条件的确立
•       3.3.2.5 多肽β-Casomorphin（1-5）（bovine）的HPLC分析
•       3.3.2.6 多肽Rrepro VIP（156-170）（human）的HPLC/LC-MS分析
•   3.4 稳定同位素标记法分析多肽
• 0/d₈-MPPZ分析多肽'>    3.4.1 d₀/d₈-MPPZ分析多肽
•     3.4.2 线性关系与动态范围
•     3.4.3 最低检测限
•   3.5 本章小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A
• 附录B

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 金星

导师: 金东日

关键词: 稳定同位素,衍生化,定量分析,多肽

来源: 延边大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 延边大学

分类号: Q51;O657.63

总页数: 60

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