猪轮状病毒VP7蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及应用

论文摘要

猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）是引起仔猪腹泻的重要病原之一,主要引起仔猪急性腹泻、呕吐、脱水。猪轮状病毒一般不引起成年猪发病,可以使成年猪呈现隐性感染,持续排毒,从而导致病毒水平传播。若与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）以及致病性大肠杆菌混合感染会使病情加重,导致高死亡率,从而给养猪业造成严重的经济损失。A群轮状病毒（RVA）属于一种无囊膜包被的病毒,它由11个分节段的双股正链RNA组成,分别编码6个结构蛋白（VP1-VP4,VP6-7）和5/6个非结构蛋白（NSP1-5/6）。VP7和VP4蛋白能够诱导产生血清型特异性中和抗体,在免疫保护和疫苗开发方面起重要作用,至今已在人类和动物中确立了 27个G血清型和37个P血清型。猪轮状病毒最常见的基因型组合为G3、G4、G5、G11和P[6]、P[7]的基因型组合。先前鉴定的在猪中主要的G血清型是G3,G4,G5和G11,与之相关的P血清型是P[6]和P[7]。本研究通过构建PoRV-VP7基因在杆状病毒表达系统中表达的rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白,制备了针对rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白的单克隆抗体;构建了以rBacmid-PoRV-VP7融合蛋白为包被抗原,具有高特异性、灵敏度的PoRV抗体检测方法。1.猪轮状病毒VP7蛋白重组杆状病毒表达载体的构建为了获得PoRV-VP7蛋白在杆状病毒表达系统中表达的融合蛋白。本研究以实验室分离并全基因测序分析后保存的一株猪轮状病毒GD-01-2015株为模板,用PCR方法扩增出vp7基因,克隆到pFast-Bac-HTA真核表达供体质粒中,然后将含有目的基因的重组供体质粒转座DH10BacTM感受态细胞,获得重组杆状质粒rBacmid-PoRV-VP7;最后在脂质体LipofectamineTM 3000的介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7。间接免疫荧光（IFA）试验结果表明,重组杆状病毒表达的融合蛋白可以被抗猪轮状病毒抗体所识别且表达为胞浆蛋白。Western-Blot结果表明,重组杆状病毒表达的分子量大小为37kDa融合蛋白可以被His标签抗体特异性识别。2.抗猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备为了获得可以用于建立PoRV快速检测方法的单克隆抗体,本研究以第一章中制备的重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7为免疫原,免疫6～8周龄的Balb/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,利用间接免疫荧光（IFA）方法筛选出3株能够稳定分泌抗PoRV-VP7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为Mab-PoRV-1G3、Mab-PoRV-2B10和Mab-PoRV-2D2;分别对筛选获得的单克隆抗体特异性及亚类特性进行鉴定。Western-Blot结果表明,这三株单克隆抗体都是PoRV-VP7蛋白特异性抗体,只与PoRV发生特异性反应;单克隆抗体亚类鉴定结果显示,Mab-PoRV-2B10为IgG,其余2株均为IgM。3.猪轮状病毒免疫猪血清抗体ELISA检测方法的建立为了建立有较好的特异性强和灵敏度的抗PoRV抗体快速检测方法,本研究以第一章中制备的重组杆状病毒表达蛋白作为包被抗原,HRP-羊抗猪IgG作为酶标抗体,建立了检测抗PoRV-VP7抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,所建立的ELISA检测方法只与所检测的已知PoRV阳性猪血清反应,而与已知PEDV阳性猪血清和已知TGEV阳性猪血清均无交叉反应。灵敏度试验结果显示,该ELISA检测方法最低能够检测出经过1:6400稀释的本研究方法所使用的的已知PoRV 阳性猪血清。分别用三种方法对92份临床猪血清样品进行检测并比对检测结果,结果显示商品化试剂盒检测和间接免疫荧光检测结果与本研究所建立的检测方法的总符合率分别为76%和91.3%。因此,本研究所建立的方法能够有效用于检测免疫猪血清所含抗PoRV抗体,该ELISA检测方法将具有一定的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一篇 文献综述 轮状病毒概况
•   1. 病原学
•     1.1 轮状病毒的形态结构
•     1.2 轮状病毒的外衣壳蛋白及功能
•     1.3 轮状病毒分型
•     1.4 理化性质
•   2. 流行病学
•   3. 发病机制和病理变化
•   4. 猪轮状病毒感染的诊断与预防
•     4.1 临床诊断
•     4.2 实验室诊断
•     4.3 预防和治疗
•   5. 研究目的与意义
• 第二篇 实验研究
•   第一章 猪轮状病毒VP7蛋白重组杆状病毒表达载体的构建
•     1. 实验材料
•       1.1 主要生物材料
•       1.2 主要试剂
•       1.3 主要仪器
•     2. 实验方法
•       2.1 PCR引物设计
•       2.2 PCR扩增PoRV-vp7基因序列
•       2.3 重组质粒pGEM-T-PoRV-VP7的构建和鉴定
•       2.4 重组供体质粒pFastBacHTA-PoRV-VP7的构建和鉴定
•       2.5 重组杆状病毒穿梭载体的构建和鉴定
•       2.6 重组杆状病毒rBacmid-PoRV-VP7的制备
•     3. 结果
•       3.1 Vero细胞增殖PoRV病毒
•       3.2 杆状病毒转移载体的构建
•       3.3 重组杆状病毒的鉴定
•     4. 讨论
•   第二章 抗猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备
•     1. 实验材料
•       1.1 生物材料
•       1.2 实验试剂
•       1.3 主要仪器
•     2. 实验方法
•       2.1 免疫原的制备
•       2.2 杂交瘤细胞的制备
•       2.3 阳性克隆筛选（间接免疫荧光法（IFA））方法的建立
•       2.4 阳性杂交瘤细胞的间接免疫荧光（IFA）筛选
•       2.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆及建株
•       2.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏
•       2.7 单克隆抗体生物学特性鉴定
•       2.8 腹水的制备以及纯化
•     3. 结果
•       3.1 阳性克隆筛选（间接免疫荧光法（IFA））方法的建立
•       3.2 IFA方法筛选阳性克隆并建株
•       3.3 单克隆抗体生物学特性鉴定
•     4. 讨论
•   第三章 猪血清中抗猪轮状病毒抗体ELISA检测方法的建立
•     1. 实验材料
•       1.1 主要材料
•       1.2 主要试剂
•       1.3 主要仪器
•     2. 实验方法
•       2.1 包被抗原的制备
•       2.2 间接ELISA方法的建立
•       2.3 间接ELISA方法临界值的确定
•       2.4 间接ELISA方法特异性试验
•       2.5 间接ELISA方法灵敏度试验
•       2.6 间接ELISA方法重复性试验
•       2.7 临床检测
•     3. 结果
•       3.1 包被抗原的制备
•       3.2 间接ELISA方法的建立
•       3.3 间接ELISA方法临界值的确定
•       3.4 间接ELISA方法特异性试验
•       3.5 间接ELISA方法灵敏度试验
•       3.6 间接ELISA方法重复性试验
•       3.7 临床检测
•     4. 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄晓星

导师: 金文杰,秦爱建,单玉平

关键词: 猪轮状病毒,蛋白,杆状病毒表达系统,单克隆抗体,间接方法,昆虫细胞

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 江苏省“青蓝工程”,江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD),江苏省农业三新工程(SXGC[2015]077),常州市科技支撑项目(CE20152006)

分类号: S852.651

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000409

总页数: 80

文件大小: 5486K

下载量: 241