胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxⅠ的原核表达及其介导细胞毒性研究

论文摘要

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌。本研究旨在利用大肠杆菌原核表达系统获得具有生物学活性的ApxⅠ重组蛋白并对其介导的宿主细胞毒性进行初步研究。首先,进行了APP ApxⅠA基因的生物信息学分析。ApxⅠA蛋白含有1023个氨基酸,属稳定的亲水性蛋白,无跨膜螺旋和信号肽;预测其二级和三级结构,富含α螺旋结构（469,45.85%）,无规则卷曲（284,27.76%）,还有延展链（193,18.87%）和β转角（77,7.53%）;预测发现其第631-841位氨基酸为B细胞抗原表位密集区。其次,免疫制备了APP ApxⅠ多克隆鼠血清抗体。重组表达ApxⅠA’蛋白,将其皮下免疫小鼠3次获得免疫血清,间接ELISA检测其血清效价达到1:102400,通过免疫印迹证实能特异性识别ApxⅠA’重组蛋白。最后,表达并获得了具有溶血活性和介导细胞毒性的重组ApxⅠ蛋白。以大肠杆菌BL21（DE3）pLysS为表达菌,表达pET32a-ApxⅠCA质粒,获得ApxⅠ重组蛋白。90μg/ml该蛋白进行溶血实验能使1%绵羊红细胞完全溶解,证实其具有良好溶血活性;综合细胞形态学变化和CCK-8检测结果建立了以PAM为研究对象的重组ApxⅠ蛋白细胞毒性的细胞模型;50μg/ml的ApxⅠ重组蛋白刺激PAM细胞24h后,AO-EB染色可观察到细胞凋亡现象、Caspase-3的蛋白酶活力和mRNA的转录水平明显升高,证实本研究设定的低浓度该蛋白能通过细胞凋亡的方式介导细胞毒性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 文献综述
•   1.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌概述
•   2.APP Apx外毒素研究进展
•     2.1 APP毒素的种类与血清型
•     2.2 APP Apx毒素分子生物学特性
•     2.3 Apx毒素蛋白的致病机理
•     2.4 RTX毒素与宿主细胞互作蛋白的研究
•   3.细菌细胞毒性的研究进展
•     3.1 细胞毒性的评价指标及检测技术方法
•     3.2 细胞凋亡概述
• 研究目的与意义
• 第一章 APP ApxⅠA基因生物信息学分析及其多克隆抗体制备
•   1 材料
•     1.1 主要生物信息数据库
•     1.2 生物信息学分析计算机软件
•     1.3 实验菌株与质粒
•     1.4 主要试剂耗材
•     1.5 主要仪器
•   2 方法
•     2.1 ApxⅠA基因的氨基酸序列的生物信息学分析
•     2.2 重组质粒构建的引物设计
•     2.3 APP基因组DNA和 ApxⅠ片段模板质粒的提取
•     2.4 ApxⅠA'片段的扩增
•     2.5 重组质粒的构建
•     2.6 重组表达质粒向大肠杆菌表达菌的转化
•     2.7 重组蛋白的表达鉴定
•     2.8 重组蛋白的Ni-NTA提纯
•     2.9 小鼠免疫
•     2.10 间接ELISA测定抗体效价
•     2.11 阳性血清免疫印迹特异性分析
•   3 结果
•     3.1 ApxⅠ蛋白的氨基酸序列生物信息学分析
•     3.2 目的片段的扩增
•     3.3 重组表达质粒的酶切鉴定
•     3.4 SDS-PAGE鉴定
•     3.5 间接ELISA测定抗体效价
•     3.6 抗体特异性免疫印迹鉴定
•   4 分析讨论
•   5 小结
• 第二章 APP ApxⅠ蛋白表达及其介导宿主细胞毒性研究
•   1.材料
•     1.1 实验材料
•     1.2 主要试剂耗材
•   2.方法
•     2.1 ApxⅠCA基因的核苷酸序列同源性分析
•     2.2 ApxⅠCA的基因扩增
•     2.3 ApxⅠCA的克隆
•     2.4 ApxⅠCA基因的核苷酸序列分析
•     2.5 重组蛋白的表达与提纯
•     2.6 重组蛋白鉴定
•     2.7 溶血活性检测
•     2.8 ApxⅠ重组蛋白的细胞毒性模型建立
•     2.9 AO-EB荧光染色
•     2.10 Caspase-3 酶活检测
•     2.11 Caspase-3,8,9 的实时荧光定量PCR
•   3.结果
•     3.1 ApxⅠCA基因核苷酸序列同源性分析
•     3.2 目的片段的扩增
•     3.3 重组质粒的酶切鉴定
•     3.4 ApxⅠCA基因的核苷酸序列分析
•     3.5 SDS-PAGE鉴定
•     3.6 免疫印迹鉴定
•     3.7 溶血活性
•     3.8 细胞毒性模型建立
•     3.9 AO-EB荧光染色结果
•     3.10 Caspase-3 酶活检测
•     3.11 Caspase-3,8,9 的实时荧光定量PCR
•   4.分析讨论
•   5.小结
• 结论与创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录
•   附录1
•   附录2
•   附录3
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 田瑾

导师: 曹三杰

关键词: 胸膜肺炎放线杆菌,重组蛋白,原核表达,细胞毒性

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000865

总页数: 71

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