拟南芥端粒酶逆转录酶的非生物胁迫抗性功能及抗原表位特征

论文摘要

端粒酶是真核细胞中具有逆转录酶活性,能够合成端粒DNA的核糖核蛋白复合物,而端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase,TERT）是端粒酶的核心组分。研究表明,TERT具有基因表达调控、线粒体功能调节、胁迫应激保护等非端粒功能,但是研究主要集中于动物方面,而植物端粒酶逆转录酶是否具有非端粒功能仍不明确。因此,本文旨在研究AtTERT在拟南芥及大肠杆菌体内的非端粒功能,结果如下:构建拟南芥pCAMBIA2300-GFP-AtTERT真核表达载体,通过烟草瞬时表达及拟南芥稳定表达确定GFP-AtTERT融合蛋白主要定位于细胞核,在细胞质中也有较弱定位;对转AtTERT拟南芥进行非生物胁迫抗性分析显示,转AtTERT拟南芥较野生型及突变体拟南芥抗盐性增强,而渗透胁迫抗性无显著性变化。构建pET32a/pGEX-4T-1-AtTERT原核表达载体,遗传转化大肠杆菌,诱导表达可溶性AtTERT蛋白进行功能分析,结果显示转AtTERT大肠杆菌盐胁迫抗性、渗透胁迫抗性及过氧化氢耐受性增强,而其冷冻抗性减弱。以上结果表明,AtTERT在拟南芥及大肠杆菌非生物胁迫中发挥重要作用。基于AtTERT功能结构域预测,分别构建含有AtTERT不同功能结构域的原核表达载体pET32a-P1/2/3/4,诱导纯化蛋白后ELISA鉴定其抗原性,并探究AtTERT的保守功能结构域（P4）对大肠杆菌响应非生物胁迫的影响。Protean软件分析显示,AtTERT蛋白抗原表位最可能位于氨基酸肽链的N端及中部;ELISA鉴定显示,各融合蛋白均有反应信号,而仅含有保守功能结构域的P4蛋白抗原性最强;转P4大肠杆菌盐及渗透胁迫抗性均减弱。以上结果表明,AtTERT保持各结构域的完整性是保证其行使功能的结构基础。综上,本研究初步证明AtTERT具有非端粒功能,为继续深入研究TERT蛋白非端粒功能奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 1 引言
•   1.1 端粒酶概述
•   1.2 非端粒功能
•   1.3 端粒酶与逆转录酶
•   1.4 研究目的与意义
• 2 AtTERT在拟南芥超表达及其对非生物胁迫抗性的影响
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 材料及耗材
•     2.1.2 试剂
•     2.1.3 引物序列
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 质粒模板克隆拟南芥AtTERT基因
•     2.2.2 构建pCAMBIA2300-GFP-AtTERT真核表达载体
•     2.2.3 AtTERT蛋白的烟草瞬时表达
•     2.2.4 侵染转化拟南芥
• 1代植株'>    2.2.5 PCR鉴定转AtTERT拟南芥T₁代植株
•     2.2.6 转基因拟南芥AtTERT蛋白细胞定位观察
•     2.2.7 筛选转AtTERT拟南芥纯合株系
•     2.2.8 筛选转AtTERT拟南芥高表达株系
•     2.2.9 鉴定AtTERT突变体
•     2.2.10 转AtTERT拟南芥非生物胁迫处理
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 质粒模板克隆拟南芥AtTERT基因
•     2.3.2 构建pCAMBIA2300-GFP-AtTERT真核表达载体
•     2.3.4 AtTERT蛋白主要定位于细胞核
•     2.3.5 转AtTERT拟南芥植株非生物胁迫分析
•   2.4 讨论
• 3 AtTERT转化大肠杆菌及其对非生物胁迫抗性的影响
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 材料及耗材
•     3.1.2 试剂
•     3.1.3 引物序列
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 无缝克隆法构建pET32a/pGEX-4T-1-AtTERT原核表达载体
•     3.2.2 AtTERT蛋白诱导表达及鉴定
•     3.2.3 AtTERT对大肠杆菌生长特性的影响
•     3.2.4 转AtTERT大肠杆菌非生物胁迫抗性检测
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 构建pET32a/ pGEX-4T-1-AtTERT原核表达载体
•     3.3.2 AtTERT蛋白的诱导表达及鉴定
•     3.3.3 AtTERT抑制大肠杆菌的生长
•     3.3.4 转AtTERT大肠杆菌对非生物胁迫响应
•   3.4 讨论
•     3.4.1 AtTERT诱导表达条件优化
•     3.4.2 AtTERT在大肠杆菌非生物胁迫中发挥重要作用
• 4 AtTERT蛋白抗原表位特征及其抗原性
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 材料及耗材
•     4.1.2 试剂
•     4.1.3 引物序列
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 AtTERT蛋白潜在抗原表位预测
•     4.2.2 缺失不同功能结构域的AtTERT突变体
•     4.2.3 无缝克隆法构建pET32a-P1/P2/P3/P4原核表达载体
•     4.2.4 Trx-His-P1/P2/P3/P4-His融合蛋白原核表达及鉴定
•     4.2.5 优化Trx- His -P1/P2/P3/P4- His融合蛋白纯化条件
•     4.2.6 ELISA试剂盒鉴定分段融合蛋白抗原性
•     4.2.7 P4对大肠杆菌响应盐胁迫及渗透胁迫影响
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 AtTERT蛋白抗原表位预测
•     4.3.2 无缝克隆法构建pET32a-P1/P2/P3/P4原核表达载体
•     4.3.3 Trx- His -P1/P2/P3/P4-His融合蛋白原核表达及鉴定
•     4.3.4 Trx-His-P1/P2/P3/P4-His融合蛋白纯化条件优化
•     4.3.5 AtTERT分段融合蛋白抗原性
•     4.3.7 P4降低大肠杆菌盐胁迫及渗透胁迫抗性
•   4.4 讨论
•     4.4.1 AtTERT抗原表位预测显示主要位于肽链N端及中部
•     4.4.2 AtTERT的保守功能结构域抗原性最强
•     4.4.3 AtTERT保守功能结构域降低大肠杆菌盐及渗透胁迫抗性
• 5 结论
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙玉萍

导师: 卢存福

关键词: 拟南芥端粒酶逆转录酶,亚细胞定位,酶联免疫,非端粒功能,抗原表位

来源: 北京林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京林业大学

分类号: Q945

DOI: 10.26949/d.cnki.gblyu.2019.001241

总页数: 96

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