张宏华郝小平肖芸
（粤北人民医院广东韶关512026）
【摘要】目的：探讨百草枯对健康者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcellPBMC)骨桥蛋白（osteopontinOPN），核转录因子-KB（Nuclearfactor-kB,NF-KB)的影响。方法：健康体检者6例，取外周静脉血分离获得PBMC，以5×105个细胞/孔种入96孔细胞培养板，分3组培养12小时。A1组：正常PBMC;A2组：正常PBMC＋50ng/ml百草枯；A3组：正常PBMC＋100ng/ml百草枯。观察培养前后细胞形态变化，收集各组细胞培养上清检测骨桥蛋白水平，收获细胞后检测胞内NF-KB。结果：各组细胞培养前后细胞形态、数量无明显变化；从A1组到A3组，细胞培养上清骨桥蛋白水平及胞内NF-KB含量呈逐组增高。结论：百草枯影响细胞内NF-KB，导致骨桥蛋白的大量分泌，可能是其引起肺组织损伤的原因。
【关键词】百草枯；单个核细胞；骨桥蛋白；核转录因子-KB
【中图分类号】R969【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）06-0171-02
Thesynergeticeffectofparaquetonosteopontin,Nuclearfactor-KBfromPeripheralbloodmononuclearcellsinhealthyvolunteers
ZhangHonghua,HaoXiaoping,XiaoYun.DepartmentofRespiratoryDisease,YuebeiRemingHospital,Shaoguan512026,China
【Abstract】ObjectiveToinvestigatethesynergeticeffectofparaquetonosteopontin(OPN),Nuclearfactor-kBfromperipheralbloodmononuclearcell(PBMC)inhealthyvolunteers.MethodsPeripheralbloodmononuclearcellsfrom6healthyvolunteerswereobtainedaftercentrifugalization,5×105PBMCs/wellseededin96wellscellcultureplatewerepidedinto3groupsforcultivating12hours.A1group;normalPBMC;A2group:normalPBMC＋50ng/mlparaquet;A3group:normalPBMC＋100ng/mlparaquet.Cellmorphologicchangesbeforeandafterculturewereobserved,OPNofculturesupernatantweredetectedbyELISA,NF-KBwithincellsweredetectedbywesternblot.ResultsCellappearanceandamountbeforeandafter12hoursculturedidn’tshowmarkedchangeinthreegroups;TherewereobviousdifferenceaboutlevelsofOPNwithinthreegroups;SowaslevelofNF-KB.ConclusionsParaquetsignificantlyincreasedOPNofproductionofPBMC,raisedlevelsofNF-KBwithinPBMC,maybegraduallyinducelungorganizationdamage.
【Keywords】Paraquet;Peripheralbloodmononuclearcell;Osteopontin;Nuclearfactor-kB
我们在临床工作中发现，许多百草枯通过皮肤中毒患者，早期主要表现为急性肺损伤，晚期出现肺纤维化，抢救治疗比较棘手，死亡率高，有文献报道其死亡率高达80%以上[1]，百草枯诱导肺损伤的机制尚不明确，故我们通过探讨百草枯对健康体检者外周血单个核细胞炎性介质的影响，初步探讨百草枯诱导肺损伤的机制。
1.材料和方法
1.1标本来源
2010年1月至2013年3月我院健康体检者；年龄31岁～46岁，平均（34.32±5.81）岁，其中男3例，女3例，所有患者均知情同意。排除标准：①合并糖尿病，肝肾疾病，心脑血管疾病，急慢性感染，恶性肿瘤，自身免疫性疾病等；②近2月内使用过糖皮质激素，大环内酯类抗生素。
1.2研究方法
1.2.1健康体检者外周血单个核细胞分离抽取健康体检者外周血3ml，肝素抗凝，加入人淋巴细胞分离液离心，末次离心后台盼兰染色，计算出存活细胞百分率，获取足量的单个核细胞。
1.2.2人单个核细胞的培养和标本收集将单个核细胞以5×105个细胞/孔种入96空细胞培养版，每人份接种2空，分别检测细胞培养上清OPN,胞内NF-KB。分三组培养12小时，A1组：正常PBMC；A2组：正常PBMC＋50ng/ml百草枯；A3组：正常PBMC＋100ng/ml百草枯，观察培养前后细胞形态变化，各组收集培养上清检测OPN，收集细胞检测NF-KB，OPN水平的检测：采用酶联免疫法检测，按说明书操作，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司（进口分装）；胞内NF-KB含量的检测，采用Westernblot检测。
1.3统计学方法
采用QuantityOne2.6.4图像分析仪对图像进行分析，应用SPSS13.0统计软件包处理数据，结果以（x-±s）表示，采用卡方检验，组间比较用t检验，P＜0.05为统计学差异有显著性。
2.结果
2.1三组细胞培养前后细胞形态、数量无明显变化；
2.2培养后三组OPN水平及胞内NF-KB灰度比值变化，差异具有显著性，见下表。
表培养后三组OPN水平及胞内PKC灰度比值变化
组别OPN(ug/L)NF-KB
A126.32±3.510.28±0.04
A238.12±4.26a)0.39±0.06b)
A355.22±6.11a)0.45±0.06b)
注：a),b)表示组间比较，P＜0.01.
3.讨论
百草枯又名对草快，化学名称是1,1﹣二甲基﹣4,4联吡啶阳离子盐，可经皮肤接触，呼吸道吸入或误服造成中毒。PBMC是百草枯中毒患者炎性细胞因子的重要来源，我们通过预实验，确定2种不同浓度的百草枯对健康者外周血单个核细胞骨桥蛋白及蛋白激酶C的影响，初步探讨百草枯引起肺损伤的机制，为临床治疗提供新的思路。
OPN是一种多功能细胞因子，我们在前期的研究中发现，肺纤维化患者血清OPN水平明显增高[2]；百草枯中毒患者肺泡灌洗液中骨桥蛋白水平也明显升高[3]；本次实验说明百草枯能诱导健康体检者外周血单个核细胞OPN的产生，并且与浓度成递增效应,说明OPN参与肺纤维化的发生，发展，其机制如下；OPN通过影响细胞外基质失衡，导致肺泡壁和肺泡腔细胞外基质的沉积，促进肺纤维化的发生[4]；诱导肺泡上皮细胞的增殖，影响成纤维细胞的迁移，转型，加速肺纤维化的发展。
NF-KB是多种炎症介质基因表达所必须的一种具有基因转录多向调控作用的转录因子，正常情况下，NF-KB在胞浆内与其抑制因子IKB结合，不显示转录活性，在变应原的刺激下，炎症信号作用于细胞，活化IKB激酶使IKB磷酸化后降解，释放出NF-KB,并迅速从细胞浆转入细胞核，与目的基因的启动子序列结合，指导该基因的转录过程，如OPN等多种炎症因子都受到NF-KB的调控[5]。我们的研究结果显示：健康体检者PBMC与两种浓度的百草枯培养12小时后，组间比较，培养上清OPN及胞内NF-KB含量均有显著差别，说明在百草枯的刺激下，健康体检者PBMC分泌OPN的能力明显增加，并且在一定浓度范围内，刺激浓度越高，分泌量越多。
我们从体外探讨不同浓度的百草枯对健康体检者外周血单个核细胞炎性介质的影响，一定程度上模拟体内环境，部分了解百草枯引起肺纤维化的机制，但体内环境较体外远为复杂，如需进一步探讨其机制，尚需进一步研究。
【参考文献】
[1]佟飞，田英平，石汉文等。急性百草枯中毒大鼠肺组织中基质金属蛋白酶及其组织抑制表达变化的研究[J].中国急救医学，2006,26（1）：41-43.
[2]张宏华，邓春燕，黄伟玉等。骨桥蛋白在肺纤维化患者的表达及醋酸泼尼松对其影响.[J].临床肺科杂志，2011；16（5）：666-667.
[3]张宏华，郝小平，肖芸。百草枯中毒患者肺泡灌洗液中骨桥蛋白及TGF-β的变化.[J].临床肺科杂志，2015；20（3）：552-553.
[4]KohanM,BaderR,PuxedduI,et,al.Enhancedosteopontinexpressioninamurinemodelofallergen-inducedairwayremodeling[J].ClinExpAllergy,2007.37(10):1444-1454.
[5]D.GHaiderN,LeuchtenG,Schaller,etal.C-reactiveproteinisexpressedandsecretedbyperipheralbloodmononuclearcells.ClinicalandExperimentalImmunology,2006,146:533-539.