碳代谢调控蛋白CcpA对植物乳杆菌代谢低聚果糖的转录调控机制研究

论文摘要

低聚果糖作为一种常见的益生元,具有选择性地促进肠道中植物乳杆菌的生长从而显著改善肠道菌群平衡的功能,但是关于其代谢通路及调控机理的研究还处于起步阶段。前期研究中,我们发现了两个基因簇sacPTS1和sacPTS26参与到植物乳杆菌利用FOS的代谢过程,转录调控因子CcpA可能作为全局调控因子参与调控。为了验证该假设,本研究以CcpA蛋白为研究对象,通过体内外实验验证CcpA与两个基因簇启动子区域cre位点的特异性结合;通过基因敲除和RNA-seq研究CcpA主导的CCR效应,利用ChIP-seq实验探究了CcpA对靶基因的调控方式。论文的主要结论如下:（1）sacPTS1基因簇有两个操纵子转录单元组成,其中,sacK和pts1为一个操纵子单元,操纵子sacA、sacR和agl2为一个操纵子单元;基因簇sacPTS26是一个完整的操纵子。利用生物信息学软件RSAT对CcpA在植物乳杆菌中的结合位点生成对应的motif,并在两个靶基因上发现了6个潜在的cre位点。为验证CcpA与这些潜在cre位点的特异性结合,对CcpA进行大肠杆菌异源表达并进行体外EMSA实验,证实了CcpA与含cre位点区域的特异性结合。体内ChIP-qPCR实验确定CcpA对靶基因启动子区DNA具有很高的富集度,再次证实两者间的相互作用。（2）利用Cre-lox敲除系统构建了ccpA基因敲除突变株,比较植物乳杆菌ST-III野生型和突变型菌株以葡萄糖或FOS为唯一碳源下基因的差异化表达和可能的调控方式。在两种碳源下,CcpA的失活显著影响着菌株的生长和代谢物的产生。分别以葡萄糖和FOS为碳源时,突变型与野生型相比大约有15%和12%的基因发生差异化表达;然而当CcpA缺失之后,在FOS生长与在葡萄糖下生长相比只有7%的基因发生显著变化。CcpA缺失后,上调基因中主要涉及到碳水化合物代谢,而下调最为显著的是参与脂肪酸合成的基因。尽管大部分显著变化的基因受到葡萄糖诱导的CcpA的调控,但FOS也可诱导CCR效应。此外,CcpA的失活也导致同型发酵向混酸发酵的转化。通过调控方式的分析,发现CcpA可以通过直接、间接和直接-间接相结合三种方式对靶基因进行调控。（3）为了分析CcpA在植物乳杆菌ST-III中的直接调控方式和结合位点,利用ChIP-seq实验对植物乳杆菌中所含的转录因子结合位点进行全基因组扫描。结果表明,共捕获到507个不同富集倍数peaks。共鉴定出5个motif,在植物乳杆菌ST-III基因组上共寻找到159个调控基因。结合RNA-seq数据,共发现39个有motif的基因发了显著变化,表明这些基因受CcpA的直接调控。最后以CcpA为中心,构建了一个全局调控网络模型,探讨了植物乳杆菌代谢FOS的全局调控机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
•   1.1 乳酸菌及其特点
•   1.2 低聚果糖及其特点
•   1.3 乳酸菌代谢低聚果糖的研究进展
•   1.4 乳酸菌的糖代谢调控研究
•   1.5 CcpA蛋白及其调控机制
•   1.6 基因表达调控中的相关技术
•     1.6.1 EMSA
•     1.6.2 RNA-seq
•     1.6.3 ChIP
•   1.7 研究目的与意义
•   1.8 研究内容
• 第2章 CcpA与靶基因相互作用的研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 菌株及质粒
•     2.2.2 试剂及溶液配制
•     2.2.3 实验仪器
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 菌株的培养
•     2.3.2 分子生物学基本操作
•     2.3.3 靶基因转录单元的测定
•     2.3.4 CcpA与 cre结合位点的预测
•     2.3.5 CcpA大肠杆菌异源表达载体的构建
•     2.3.6 重组蛋白CcpA的表达、鉴定及纯化
•     2.3.7 EMSA实验
•     2.3.8 ChIP-qPCR实验
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 靶基因结构分析
•     2.4.2 CcpA与 cre结合位点的分析
•     2.4.3 CcpA蛋白的异源表达
•     2.4.4 重组蛋白CcpA的诱导表达及纯化
•     2.4.5 体外分析验证CcpA蛋白与潜在cre位点的特异性结合
•     2.4.6 体内实验分析验证CcpA蛋白与启动子区域的结合
•   2.5 本章小结
• 第3章 CcpA的碳代谢阻遏（CCR）调控研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 菌株及质粒
•     3.2.2 试剂及溶液配制
•     3.2.3 试验仪器与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.0 菌株的培养
•     3.3.1 ccpA基因敲除突变株（?ccpA）的构建
•     3.3.2 野生型和突变株利用不同碳源能力的测定
•     3.3.3 野生型和突变株在混合碳源下生长曲线的测定
•     3.3.4 糖残留量的测定
•     3.3.5 混合碳源下基因表达量的测定
•     3.3.6 RNA-seq实验转录组测定
•     3.3.7 RNA-seq数据分析
•     3.3.8 代谢产物的检测
•     3.3.9 RT-PCR分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 ccpA基因敲除突变株的鉴定
•     3.4.2 野生型和突变型菌株利用不同碳源能力的比较
•     3.4.3 野生型和突变型菌株在混合碳源下的生长和基因表达
•     3.4.4 ccpA基因敲除对基因表达的影响
•     3.4.5 ccpA基因敲除对代谢产物的影响
•     3.4.6 ccpA基因敲除前后利用葡萄糖和FOS的差异转录组分析
•   3.5 本章小结
• 第4章 CcpA调控ST-Ⅲ代谢FOS的全局调控网络模型的研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 菌株及质粒
•     4.2.2 试剂及溶液配制
•     4.2.3 实验仪器与设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 染色质免疫共沉淀（ChIP-seq）样品的制备
•     4.3.2 ChIP-seq数据分析
•     4.3.3 全局调控网络模型的建立
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 全局调控因子CcpA在 ST-Ⅲ中结合位点分析
•     4.4.2 ChIP-seq和 RNA-seq数据相关性分析
•     4.4.3 调控网络分析
•   4.5 本章小结
• 第5章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位期间所开展的科研项目和发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 卢艳青

导师: 陈臣,郑华军

关键词: 植物乳杆菌,低聚果糖,碳代谢阻遏蛋白,转录组

来源: 上海应用技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 上海应用技术大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27801/d.cnki.gshyy.2019.000273

总页数: 110

文件大小: 3689K

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