组蛋白H3乙酰化对BoHV-1感染中的作用机制研究

论文摘要

牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus type 1,BoHV-1）是一种双链DNA病毒,其包括 3 种亚型,分别是 BoHV-1.1、BoHV-1.2a 和 BoHV-1.2b。BoHV-1.1（即本文中的 BoHV-1）可原发性感染造成传染性牛鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）。BoHV-1生产性感染时,部分细胞核内的病毒DNA存在于核小体,BoHV-1中病毒蛋白VP22被证实与组蛋白H4（Histone 4）乙酰化修饰降低有关,除H4外,H3（Histone 3）作为核小体中的另一个序列非常保守的组蛋白,其在病毒感染过程中是否存在作用也值得深入探究。本研究发现病毒感染后显著降低了组蛋白H3以及H3K9ac和H3K18ac为代表的乙酰化组蛋白,同时包括CBP/P300、GCN5L2和PCAF的组蛋白乙酰转移酶家族（HATs）也明显减少。HAT激活剂CTPB提高了病毒复制,反之,HAT抑制剂AA则抑制了病毒复制,恢复了病毒导致的H3K9ac表达降低,表明了 BoHV-1为有效的复制而利用组蛋白的乙酰化作用。此外,HAT抑制剂AA降低病毒立早基因（IE）和病毒衣壳蛋白VP16的表达水平。概括来说,MDBK细胞中HAT依赖性组蛋白乙酰化在病毒复制中起到了重要作用。胞内蛋白有三种降解途径:1、泛素化-蛋白酶体降解途径;2、溶酶体途径;3、自噬作用。为探究病毒是否通过介导上述途径降解乙酰化H3和HATs,于是对此进行更深层次的探索并发现:经IP实验鉴定,病毒感染后H3K9ac未泛素化,而HATs之一的GCN5L2被泛素标记,结合泛素化-蛋白酶体抑制剂MG132抑制病毒复制并恢复病毒引发的乙酰化H3表达降低,推测病毒通过泛素化-蛋白酶体途径部分地介导病毒感染造成的GCN5L2降解,从而降低细胞内组蛋白及其乙酰化;溶酶体抑制剂NH4Cl无此作用;在自噬作用方面,本研究发现病毒感染前期自噬相关蛋白水平无显著变化,而在后期,以自噬标志蛋白LC3-Ⅱ为首的一系列细胞内自噬相关蛋白含量（ATG5、LC3-I、Beclin-1）显著降低,并且血清的添加对此作用无影响。前期自噬抑制剂3-MA对于病毒复制无影响,而后期自噬抑制剂BAF可以拯救病毒感染所致的自噬相关蛋白的损耗,并抑制病毒复制。这一系列结果揭示病毒感染初期需要一定基础水平上的自噬,推测病毒感染后期可能通过抑制自噬以维持自身生存。HATs抑制剂AA可以拯救由病毒感染引发的自噬相关蛋白的降低,而HDACs抑制剂TSA则无作用,意味着HATs在病毒降低自噬相关蛋白中有一定作用,这进一步证实了 HATs和病毒复制之间的关系,侧面印证了 HAT依赖性组蛋白乙酰化在病毒复制中的重要性。本文以BoHV-1感染MDBK细胞时降低胞内H3及其乙酰化为基础,从酶解作用和细胞内三种降解途径这四种方向展开研究,初步构建了 BoHV-1在感染MDBK细胞时对H3及其乙酰化的工作机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 文献综述
•   一、牛疱疹病毒（BoHV-1）的描述
•     1、BoHV-1的病毒学特点
•     2、BoHV-1的发病机理
•       2.1 病毒的入侵与传播
•       2.2 病毒的复制、扩散和潜伏性感染
•       2.3 机体免疫反应与病毒免疫抑制
•       2.4 BoHV-1的防控与疫苗
•   二、组蛋白与组蛋白乙酰化修饰
•     1、组蛋白的概念
•     2、组蛋白修饰——乙酰化和乙酰化调节机制
•     3、组蛋白与病毒关系的研究进展
•   三、自噬
•     1、自噬的基本过程
•     2、自噬的基本生物学作用与功能
•     3、自噬与病毒感染的研究进展
•   四、本研究目的与意义
• 第一章 BoHV-1感染对MDBK细胞中组蛋白H3乙酰化水平的影响
•   1、材料
•     1.1 细胞与病毒
•     1.2 试验试剂
•   2、方法
•     2.1 台盼蓝试验检测细胞毒性
•     2.2 抑制病毒复制实验
•     2.3 Western Blot实验
•     2.4 IP实验
•     2.5 荧光定量PCR分析
•   3、结果
•     3.1 BoHV-1感染降低了MDBK细胞内组蛋白H3乙酰化水平
•     3.2 BoHV-1感染对HATs和HDACs表达的影响
•     3.3 HATs抑制剂限制BoHV-1复制
•     3.4 HATs抑制剂AA影响BoHV-1立早基因表达
•     3.5 蛋白酶体途径——介导GCN5L2降解与BoHV-1感染降低的组蛋白H3乙酰化反应有潜在关联
•   4. 讨论
• 第二章 BoHV-1感染对MDBK细胞中自噬水平的影响
•   1、材料
•     1.1 细胞与病毒
•     1.2 试验与试剂
•   2、方法
•     2.1 分析BoHV-1感染MDBK对细胞自噬的影响
•     2.2 分析自噬抑制剂3-MA和BAF对BoHV-1复制的影响
•     2.3 分析血清浓度对BoHV-1抑制自噬产生的影响
•     2.4 分析AA和TSA对BoHV-1抑制自噬产生的影响
•   3、结果
•     3.1 BoHV-1感染MDBK细胞后导致自噬相关蛋白表达下降
•     3.2 在含血清的条件下病毒感染致自噬相关蛋白表达水平下降
•     3.3 自噬抑制剂BAF抑制BoHV-1复制
•     3.4 BoHV-1感染对自噬的影响与乙酰化的相互关系
•   4、讨论
• 全文总结
• 全文创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间文章发表与学术交流情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蒋心怡

导师: 朱礼倩

关键词: 牛疱疹病毒型,组蛋白乙酰化,组蛋白乙酰化酶,自噬

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家自然科学基金面上项目(No.31772743,No.31472172),十三五国家重点研发专项子课题(No.2016YFD0500704),农业部动物免疫学重点实验室,河南省动物免疫学重点实验室开放课题(No.KLAI20170602)

分类号: S852.653

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001112

总页数: 59

文件大小: 4293K

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