对来源于Klebsiella sp. LX3的蔗糖异构酶PalⅠ的定点突变及枯草芽孢杆菌表达产物发酵转化分析

论文摘要

异麦芽酮糖（α-D-glucosylpyranosyl-1,6-D-fructofranose）生理功能优良,可作为甜味剂广泛应用,且自然界存在极少;用蔗糖异构酶（EC 5.4.99.11）转化蔗糖生产异麦芽酮糖是目前工业生产的主要方法。由于蔗糖异构酶催化蔗糖转化的过程中始终存在副产物单糖,因而对生产不利。本文以来源于Klebsiella sp LX3的蔗糖异构酶PalI为研究对象,通过定点突变和枯草芽孢杆菌异源表达来探索产物中副产物单糖的消除问题。主要研究内容如下:（1）由于主产海藻酮糖型蔗糖异构酶的产物中单糖（葡萄糖,果糖）较低,因此对主产海藻酮糖型蔗糖异构酶MutB和主产异麦芽酮糖型蔗糖异构酶PalI做比较分析。根据蛋白多序列及结构比对,发现其活性位点空间存在差异及RLDRD loop区表面亲疏水性不同,初步设计了S459A,R452A,S459A/R452A,Lyo,del-D和Lyo/del-D六个突变体,构建Escherichia coli BL21（DE3）重组菌进行表达并纯化。突变株与底物蔗糖反应,通过HPLC对产物分析获得相应的产物参数和酶学参数。结果发现突变体S459A,S459A/R452A,Lyo/del-D的异麦芽酮糖与海藻酮糖峰面积比、海藻酮糖异麦芽酮糖峰面积和与果糖葡萄糖峰面积和比值具有较大变化;其异麦芽酮糖与海藻酮糖峰面积比分别为3.5,3.4,3.3与野生型相比分别降低50%左右;而海藻酮糖异麦芽酮糖峰面积和与果糖葡萄糖峰面积和比值分别为40,49,23与野生型相比分别增高了18%,48%和降低了30%。对S459A,S459A/R452A,Lyo/del-D三个突变体做酶的动力学分析,测定Km值、Vmax;Km分别为171.6μmol/L,158.4μmol/L,160.4μmol/L;Vmax为21.3μmol/L/s,10.7μmol/L/s,4.6μmol/L/s。以4%蔗糖为底物反应1 h计算各酶的转化率,其中S459A,S459A/R452A,Lyo/del-D的转化率分别为71%,37%,72%。（2）蔗糖异构酶催化蔗糖转换的副产物为葡萄糖、果糖,其可作为微生物生长的速效碳源,被微生物利用,从而减少反应中的副产物;将蔗糖异构酶构建到pHT43载体导入食品级表达载体枯草芽孢杆菌WB800菌株中,在30℃使用LSP（LB/Sucrose/Phosphate）培养基诱导表达。用HPLC对发酵液中的各种糖组分分析发现,异麦芽酮糖与海藻酮糖峰面积比、海藻酮糖异麦芽酮糖峰面积和与果糖葡萄糖峰面积和比值的变化主要与培养基中蔗糖的浓度和发酵时间决定。在发酵24 h时,异麦芽酮糖与海藻酮糖峰面积比小于2,海藻酮糖异麦芽酮糖峰面积和与果糖葡萄峰面积和比值为92:1。蔗糖最大转化效果为培养基中20%蔗糖在24h转化完全。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 异麦芽酮糖及海藻酮糖的概述
•     1.1.1 异麦芽酮糖的理化性质
•     1.1.2 异麦芽酮糖的功能
•     1.1.3 异麦芽酮糖的市场前景
•     1.1.4 异麦芽酮糖的生产
•     1.1.5 海藻酮糖简述
•   1.2 蔗糖异构酶的概述
•     1.2.1 蔗糖异构酶的来源
•     1.2.2 蔗糖异构酶的主要特征及进化
•     1.2.3 蔗糖异构酶的三级结构
•     1.2.4 蔗糖异构酶的催化机理的发展历程
•   1.3 蔗糖异构酶在产品生产中的应用探索
•   1.4 蔗糖异构酶在应用中的问题
•   1.5 研究意义与内容
• 第二章 蔗糖异构酶PalⅠ的定点突变
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌种与质粒
•     2.1.2 培养基
•     2.1.3 实验试剂和仪器
•       2.1.3.1 实验试剂
•       2.1.3.2 实验仪器
•     2.1.4 PCR引物
•     2.1.5 试剂配制
•       2.1.5.1 酶活测定缓冲液
•       2.1.5.2 蛋白纯化缓冲溶液
•       2.1.5.3 电泳分析缓冲溶液
•       2.1.5.4 BCA蛋白浓度测定溶液
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 含有突变体基因的载体构建
•     2.2.2 重组大肠杆菌菌株的构建
•     2.2.3 突变体蛋白的表达和纯化
•       2.2.3.1 突变体蛋白的表达
•       2.2.3.2 突变体蛋白的收集
•       2.2.3.3 突变体蛋白的纯化
•     2.2.4 蛋白浓度的测定
•     2.2.5 液相标准曲线的建立
•     2.2.6 HPLC分析及酶学参数测定
•       2.2.6.1 酶纯化参数的测定
•       2.2.6.2 产物比的分析
•       2.2.6.3 酶学参数的测定
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 蔗糖异构酶突变位点的确立
•     2.3.2 蔗糖异构酶载体的构建
•     2.3.3 标准曲线的测定
•     2.3.4 突变体蛋白的表达和纯化
•     2.3.5 产物液相分析及其转化率
•     2.3.6 突变体蛋白的酶学参数的测定
•   2.4 小结
• 第三章 B.subtilis WB800异源表达PalⅠ及产物变化探索
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌种与质粒
•     3.1.2 培养基
•     3.1.3 实验试剂和仪器
•     3.1.4 PCR引物
•     3.1.5 试剂配制
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 重组pHT43-palⅠ载体构建
•     3.2.2 B.subtilis WB800/pHT43-palⅠ菌株的构建
•     3.2.3 B.subtilis WB800/pHT43-palⅠ的表达及催化分析
•     3.2.4 B.subtilis WB800/pHT43-palⅠ产物发酵分析
•     3.2.5 B.subtilis WB800 及重组菌细胞湿重测定
•     3.2.6 TLC分析蔗糖20%-PalⅠ的转化
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 pHT43-palⅠ载体的构建
•     3.3.2 B.subtilis WB800/pHT43-palⅠ的表达及产物分析
•     3.3.3 B.subtilis WB800/pHT43-palⅠ产物的发酵分析
•     3.3.4 生物量测定与蔗糖最大转化率
•   3.4 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王兵兵

导师: 李蓉

关键词: 蔗糖异构酶,异源表达,定点突变,枯草芽孢杆菌,单糖消除

来源: 大连工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业,轻工业手工业

单位: 大连工业大学

分类号: TS264.9;TS201.3

DOI: 10.26992/d.cnki.gdlqc.2019.000141

总页数: 54

文件大小: 2378K

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