KSHV K15P及其突变体的慢病毒包装与稳定细胞株的筛选及其对内皮细胞增殖迁移的影响

论文摘要

目的包装包含卡波肉瘤相关疱疹病毒（KSHV） K15P及其突变体K15P（YF）基因的慢病毒颗粒,并对此基因在EA.hy926细胞内稳定表达进行研究。方法通过PCR方法扩增获得KSHV K15P、K15P（YF）基因片段,使用限制性内切酶Not I与BamH I酶切和TA克隆法构建T载体与慢病毒表达载体pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro、pHAGE-CMV-MCS-K15P（YF）-Puro,通过lip2000将构建好的慢病毒表达载体与两种辅助包装质粒PSPAX2和pMD2.g共转染HEK 293T细胞,48 h后收集慢病毒。慢病毒感染EA.hy926细胞并通过嘌呤霉素筛选稳定表达株,Western blot检测K15P与K15P（YF）蛋白的表达。Transwell与CCK8实验检测K15P对内皮细胞的增殖迁移影响。结果成功构建慢病毒表达载体,筛选出稳定表达K15P、K15P（YF）蛋白的EA.hy926细胞。在EA.hy926细胞Transwell迁移实验中,与空载体组和K15P突变体组（0.98±0.23）比较, K15P组（2.25±0. 15）的EA. hy926细胞的迁移能力明显增强（P <0. 01）,三组细胞迁移量差异有统计学意义（F=113. 5,P <0. 01）;CCK8增殖活性实验中,与空载体组和K15P（YF）组（109. 23±12. 58）比较,K15P组（138. 69±7. 47）的EA. hy926细胞的增殖能力明显增强（P <0. 01）,三组细胞增殖活性差异有统计学意义（F=40. 78,P <0. 01）。结论 K15P蛋白增强了内皮细胞的增殖与迁移,而K15P（YF）突变体的促进细胞增殖迁移能力减弱,提示K15P蛋白可能在KS的发生发展中参与重要作用。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料来源
•   1.2 主要试剂
•   1.3 构建pHAGE-CMV-MCS-K15P-Puro、pHAGE-CMV-MCS -K15P（YF）-Puro重组质粒及鉴定
•     1.3.1 K15P、K15P（YF）基因的扩增
•     1.3.2 重组质粒的构建及鉴定
•   1.4 慢病毒的包装
•   1.5 内皮细胞的感染与筛选
•     1.5.1 感染内皮细胞
•     1.5.2 稳定株的筛选
•   1.6 Western blot 检测K15P 、K15P（YF）蛋白的表达
•   1.7 内皮细胞迁移实验
•   1.8 CCK-8细胞增殖活性实验
•   1.9 统计学处理
• 2 结果
•   2.1 重组慢病毒载体的构建与鉴定
•   2.2 内皮细胞的感染与筛选
•   2.3 慢病毒感染EA.hy926细胞后K15P 、K15P（YF）蛋白的检测
•   2.4 K15P促进内皮细胞EA.hy 926增殖和迁移
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 周畅,许常青,许方玮,方圆,陈伟,文志,林康,王林定

关键词: 卡波肉瘤相关疱疹病毒,慢病毒

来源: 安徽医科大学学报 2019年11期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,基础医学

单位: 安徽医科大学微生物学教研室,国际关系学院英语系

基金: 国家自然科学基金(编号:81271837),安徽高校自然科学研究项目(编号:KJ2012A161),安徽省自然科学基金(编号:1708085MH193)

分类号: R373

DOI: 10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2019.11.021

页码: 1765-1770

总页数: 6

文件大小: 4632K

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