欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估

论文摘要

【目的】表达欧亚类禽型（eurasian avian-like,EA）H1N1猪流感病毒（SIV）的血凝素（HA）蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013（H1N1）（ZJ245）的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA（ZJ245）,将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光（IFA）检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA（ZJ245）经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠（I组和II组）,间隔3周后进行加强免疫（二免）;同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组（III组和IV组）。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制（HI）试验和病毒中和（VN）试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠（I组和III组）用50μL（106.0EID50）的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组（II组和IV组）用A/swine/Heilongjiang/44/2009（H1N1）（HLJ44）病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA（ZJ245）的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA（ZJ245）,经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA（ZJ245）首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。106.0 EID50的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA（ZJ245）的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;106.0 EID50的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低（P<0.0001、P <0.001、P <0.05）。【结论】重组质粒pCAGGS-HA（ZJ245）能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒pCAGGS-HA（ZJ245）具有良好的免疫原性。

论文目录

• 0 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 病毒、细胞及实验动物等
•   1.2 主要试剂
•   1.3 病毒RNA提取及HA基因的扩增与鉴定
•   1.4 表达HA基因的重组表达质粒构建与鉴定
•   1.5 重组质粒p CAGGS-HA （ZJ245） 的瞬时表达及检测
•     1.5.1IFA检测
•     1.5.2 Western blot检测
•   1.6 小鼠的免疫及攻毒试验
•     1.6.1 HI抗体的测定
•     1.6.2 VN抗体的测定
•     1.6.3 脏器病毒测定
•     1.6.4 数据统计分析
• 2 结果
•   2.1 重组质粒p CAGGS-HA （ZJ245） 的构建与鉴定
•   2.2 重组质粒表达的HA的IFA与Western blot检测
•   2.3 重组质粒p CAGGS-HA （ZJ245） 免疫小鼠诱导产生的抗体水平
•   2.4 重组质粒对小鼠的免疫保护效果
•     2.4.1 小鼠体重变化
•     2.4.2 脏器病毒测定
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 贾云慧,许程志,隋金钰,吴运谱,许榜丰,陈艳,杨焕良,乔传玲,陈化兰

关键词: 欧亚类禽型猪流感病毒,蛋白,重组质粒,免疫原性,疫苗

来源: 中国农业科学 2019年05期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

基金: 国家重点研发计划项目(2017YFD0500604),黑龙江省自然基金项目(C2018072)

分类号: S852.65

页码: 930-938

总页数: 9

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