基于纳米抗体-HRP融合蛋白鸡血清中抗NDV抗体竞争ELISA检测方法的建立

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染引起的禽类传染病,是一类动物疫病,严重危害养禽业的健康发展。核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）作为NDV的主要结构蛋白,是抗NDV抗体检测方法建立的主要靶抗原。纳米抗体相比于传统抗体具有分子量小,易于基因工程改造的优点。为了建立NDV新型诊断技术,本研究基于纳米抗体的优点,将其应用于NDV新型诊断技术的研发中。本研究首先利用原核表达系统表达NDV的NP蛋白,将NDV-NP可溶性重组蛋白免疫双峰驼,然后利用噬菌体展示技术,通过3轮淘选,共筛到9株针对NP蛋白的特异性纳米抗体。随后,基于针对NDV-NP蛋白的纳米抗体,建立了纳米抗体—辣根过氧化物酶（HRP）融合蛋白制备平台,然后将该融合蛋白用于开发鸡血清中抗NDV抗体的竞争性ELISA（cELISA）检测方法。1、NDV-NP重组蛋白的表达与纯化构建重组NDV-NP重组表达载体,Western blot和SDS-PAGE分析在56 kDa有预期大小的重组蛋白NDV-NP蛋白。2、抗NDV-NP蛋白纳米抗体库的构建以及特异性纳米抗体的筛选将NP蛋白免疫双峰驼。六次免疫后,检测血清中针对NP重组蛋白的特异性抗体效价达到1:256000。分离淋巴细胞,提取总RNA,再反转录为CDNA。经巢式PCR扩增出纳米抗体的重链可变区（VHH）基因;然后,通过酶切,连接和转化得到3×108pfu/mL大小的VHH噬菌体展示文库,基因测序鉴定文库的多样性良好。以NP重组蛋白作为特异性纳米抗体淘选的包被抗原,经过3轮淘选,最终筛选出9株针对NP重组蛋白的特异性纳米抗体。3、基于纳米抗体-HRP融合蛋白鸡血清中抗NDV抗体竞争ELISA检测方法的建立首先利用不同的基因原件,构建pEGFP-NDV-NP-Nb5真核表达载体,该重组质粒转染HEK293T细胞后,IFA和Western blot结果表明,NDV-Nb5-HRP成功在HEK293T细胞中分泌表达。随后,成功建立了鸡血清中抗新城疫抗体的竞争ELISA检测方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
•   第一章 新城疫及纳米抗体的研究概况
•     1.1 新城疫的研究进展
•       1.1.1 新城疫概述
•       1.1.2 新城疫病毒特点
•       1.1.3 NDV编码的主要蛋白特点
•       1.1.4 NDV的传播方式及感染途径
•       1.1.5 新城疫的诊断
•       1.1.6 新城疫疫苗
•     1.2 纳米抗体研究进展
•       1.2.1 纳米抗体概述及特点
•       1.2.2 纳米抗体的主要应用
•     1.3 研究目的及意义
• 试验研究
•   第二章 NDV-NP重组蛋白的表达与纯化
•     2.1 试验材料与仪器设备
•       2.1.1 载体和菌株
•       2.1.2 主要试剂耗材
•     2.2 试验方法
•       2.2.1 NDV-NP基因扩增
•       2.2.2 NP蛋白的表达及纯化
•     2.3 试验结果
•       2.3.1 原核表达载体PET-28A-NDV-N构建
•       2.3.2 HIS-NP重组蛋白的诱导表达和与纯化
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第三章 抗NDV-NP蛋白纳米抗体库的构建以及特异性纳米抗体的筛选
•     3.1 试验材料
•       3.1.1 质粒、菌株与实验动物
•       3.1.2 主要试剂与材料
•     3.2 试验方法
•       3.2.1 免疫双峰驼
•       3.2.2 纳米抗体抗体文库的构建
•       3.2.3 抗NP蛋白特异性纳米抗体的淘选
•     3.3 试验结果
•       3.3.1 抗NP蛋白抗体滴度测定
•       3.3.2 纳米抗体文库的构建
•       3.3.3 筛选过程重组噬菌体的富集情况
•       3.3.4 抗NP蛋白特异性纳米抗体的ELISA鉴定
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
•   第四章 基于纳米抗体-HRP融合蛋白鸡血清中抗NDV抗体竞争ELISA检测方法的建立
•     4.1 试验材料
•       4.1.1 质粒,菌株和细胞系
•       4.1.2 主要试剂
•       4.1.3 主要仪器设备
•     4.2 试验方法
•       4.2.1 构建PEGFP-N1-NDV-NP-NB5 真核载体
•       4.2.2 真核表达NDV-NP-NB5 蛋白
•       4.2.3 验证NP蛋白与NDV-NP-NB5 的亲和力
•       4.2.4 确定NP与 NDV-NP-NB5 的最佳稀释浓度
•       4.2.5 确定竞争ELISA方法的血清稀释度和孵育时间
•       4.2.6 竞争ELISA方法检测SPF鸡血清确定CUT-OFF值
•       4.2.7 建立竞争ELISA方法检测临床鸡血清
•     4.3 试验结果
•       4.3.1 PEGFP-NDV-NP-NB5 真核表达载体的构建
•       4.3.2 NDV-NP-NB5 的表达以及与NDV-NP蛋白亲和力的鉴定
•       4.3.3 确定竞争ELISA的条件
•       4.3.4 竞争ELISA方法检测临床鸡血清
•     4.4 讨论
•     4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘青源

导师: 赵钦

关键词: 禽新城疫病毒,核衣壳蛋白,纳米抗体,噬菌体展示文库,竞争性

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: “十三五”国家重点研发计划(编号:2016YFD0500800)

分类号: S852.4

总页数: 53

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