一、人cbl基因真核表达载体的构建及表达（论文文献综述）
姜翰[1]（2021）在《苹果棕榈酰转移酶基因MdPAT16促进糖分转运和增强耐盐性机理研究》文中研究指明中国是主要的苹果生产国,苹果栽培的面积和产量占世界产量的一半以上,而在中国的苹果产区,土壤盐渍化特别是次生盐渍化发生普遍,严重制约了我国苹果产业的发展。如何抵御土壤盐害,对提高苹果生产效益和果实品质具有重要意义。糖在植物的生理代谢、生长发育中起重要作用,它不仅为植物生长提供能量的能源供应物质,而且是决定某些农副产品质量和商品价值的关键。碳水化合物可作为植物生长发育的碳骨架,提高植物对非生物胁迫的抵抗力。糖代谢是植物生物代谢过程中的一个重要环节,是脂质代谢和核酸代谢的信息载体,为细胞的生长发育提供足够的营养物质。前期研究发现,苹果MdCIPK13是一个盐胁迫应答CIPK（CBL-interacting protein kinase）蛋白激酶,能够与蔗糖转运蛋白MdSUT2.2相互作用,并在盐胁迫下磷酸化MdSUT2.2,提高其转运活性,从而促进苹果植株和果实的蔗糖累积,但MdCIPK13如何应答盐胁迫尚不清楚。CBL（Calcineurin B-like protein）蛋白作为CIPK蛋白的上游蛋白,能够通过与CIPK形成蛋白复合体,响应多种胁迫信号,在拟南芥中,棕榈酰基转移酶蛋白（Protein Acyl-Transferase,PAT）与CBL互作应答盐胁迫,但响应盐胁迫的机理并不清楚。基于上述研究,我们推测棕榈酰基转移酶蛋白可能通过MdCBLs调控MdCIPK13-MdSUT2.2的功能。通过转录组数据与荧光定量PCR数据相结合,鉴定得到了苹果中的一个棕榈酰基转移酶基因MdPAT16。通过遗传转化,得到了苹果MdPAT16过表达的转基因‘嘎拉’苹果组培苗,过表达以及RNAi的转基因发根苹果苗,以及过表达和RNAi的转基因愈伤组织。在此基础上,对苹果MdPAT16的功能进行了系统研究,得到了如下结果:1.棕榈酰基转移酶与苹果耐盐性及糖分累积密切相关。适度盐胁迫（1 mmol/L以及10 mmol/L的Na Cl处理）‘平邑甜茶’实生苗糖含量显着增加,表明盐胁迫与糖分累积密切相关。采用10μM的2-溴棕榈酸（2-BP,棕榈酰化抑制剂）处理‘平邑甜茶’实生苗,发现施加2-BP处理的植株较对照处理耐盐性显着降低,表明棕榈酰化能够影响植株的耐盐性。在苹果的全基因组中共鉴定得到了30个MdPAT家族成员,通过对30个成员的荧光定量PCR结果,结合转录组数据的交叉比对,确定了一个在盐胁迫下高表达的MdPATs,MdPAT16。通过对不同物种中的PAT16的蛋白序列进行比对发现,苹果中的MdPAT16与白梨（Pyrus×bretschneideri）的PAT16亲缘关系最为接近。MdPAT16的ORF全长为1146 bp,共编码381个氨基酸,对MdPAT16的蛋白序列进行结构域分析发现,MdPAT16的蛋白包含PAT家族特有的DHHC以及ANK结构域,属于典型的PAT家族成员;亚细胞定位分析表明,MdPAT16定位于细胞质膜上,q RT-PCR结果表明,MdPAT16受盐胁迫诱导。2.MdPAT16的功能鉴定。将MdPAT16全长的CDS连接GFP标签,以农杆菌侵染的方法获得了5个35S::MdPAT16-GFP的转基因苹果组培苗株系,其MdPAT16的m RNA水平以及蛋白水平均显着上调。以150 mmol/L的Na Cl处理MdPAT16过表达以及转入空载体的苹果株系,结果表明,MdPAT16的过表达株系盐抗性以及可溶性糖含量均显着高于对照组。同样,用发根农杆菌侵染得到了MdPAT16过表达（MdPAT16-OE）和沉默表达（MdPAT16-RNAi）的株系各三株,分别进行盐处理,并检测植株的糖含量。结果表明,在MdPAT16过表达株系中,抗盐性以及糖含量均有显着提升,而在MdPAT16-RNAi的株系中,抗盐性以及糖含量则显着下调,这些结果均表明,MdPAT16编码的棕榈酰基转移酶能够正调控抗盐性以及糖含量。为进一步验证MdPAT16是否编码一个棕榈酰基转移酶蛋白,将MdPAT16在酵母棕榈酰基转移酶突变体akr1中表达。功能互补实验表明,MdPAT16蛋白能够互补akr1棕榈酰基转移酶缺失的表型,而MdPAT16的DHHC结构域突变体MdPAT16C244A则失去弥补棕榈酰基转移酶缺失表型的能力,且酰基-生物素交换实验同样证明MdPAT16有自棕榈酰化的活性,这些结果表明MdPAT16是一个典型的棕榈酰基转移酶蛋白。3.MdPAT16与MdCBL1蛋白相互作用。为进一步验证MdPAT16是如何发挥抵御盐胁迫,促进糖累积的功能,利用苹果愈伤组织进行了一系列遗传转化和相关分析,发现MdCBL1可能与MdPAT16相互作用。随后,采用Co-IP、Pull-Down和Bi FC试验,在体内以及体外分别验证了二者的互作关系。同时,双荧光素酶互补实验进一步验证了MdPAT16与MdCBL1的互作。在互作的基础上加入Na Cl,发现外施Na Cl能够显着提高二者互作强度。体内Co-IP实验证明MdPAT16能够将MdCBL1棕榈酰化,同时,ABE实验结果表明,MdCBL1的第3位半胱氨酸残基是发生棕榈酰化的关键位点;MdCBL1棕榈酰化的缺失会导致MdCBL1的亚细胞定位由质膜迁移到细胞核和胞质中;蛋白降解实验同样表明,MdPAT16通过棕榈酰化,稳定了MdCBL1的蛋白表达。4.MdPAT16通过MdCBL1调控苹果糖分含量。为进一步分析MdPAT16是如何调控糖含量的,用发根农杆菌介导转化的方式,获得了MdCBL1过表达、沉默以及第3位半胱氨酸残基突变的转基因根系。对转基因苹果根系和糖含量的检测表明,MdCBL1能够促进糖的积累;在MdPAT16过表达的背景上,进行了一系列瞬时表达试验,发现共注射果实也表现出相同的结果。因此,MdPAT16可能通过棕榈酰化MdCBL1调控糖和花青苷积累。之前的研究证明,MdCBL1/MdCIPK13-MdSUT2.2通路可以在液泡内诱导糖的积累,鉴于MdCBL1与MdCIPK13之间的相互作用,推测MdCIPK13参与MdPAT16对盐胁迫应答和糖累积的调节过程。为验证上述假说,利用病毒载体对苹果果实进行了瞬时表达试验,构建了过表达载体MdCIPK13-IL60与抑制载体MdCIPK13-TRV,并进行苹果果实注射试验。发现MdCIPK13-IL60可促进苹果果实内的糖积累,MdCIPK13-TRV则可抑制糖类积累。此外,MdCIPK13-TRV抑制了MdPAT16-IL60+MdCIPK13-TRV共注射导致的糖积累,表明MdCIPK13参与了MdPAT16-MdCBL1介导的糖分积累。
李静[2]（2021）在《大豆GmCBL6基因启动子的克隆及功能分析》文中指出启动子能够决定基因的表达水平,在基因转录调控中占有重要地位。植物启动子的研究一直是分子生物学的研究热点之一,对如何更好的控制外源基因在转基因植物中的表达具有重要意义。大豆在我国被广泛种植,盐碱、干旱等环境因素严重影响了大豆的产量和品质。钙调磷酸酶B样蛋白（calcineurin B-like protein,CBL）是一类钙离子受体,在植物逆境胁迫响应过程中具有重要作用。本课题组前期从大豆中克隆了GmCBL6基因,通过对转GmCBL6基因烟草的抗逆性鉴定结果表明,该基因参与了大豆耐盐和抗旱胁迫反应,对该基因启动子的研究能进一步鉴定该基因的功能。本研究从大豆黑农44基因组中克隆了GmCBL6基因启动子全长及4个不同长度的5’缺失片段,通过烟草的遗传转化,分析GmCBL6基因启动子分子结构及功能。研究结果如下:1.运用PCR克隆得到大豆GmCBL6基因全长启动子,序列长度为1569bp。利用在线软件Plant CARE对启动子序列进行分析,分析结果显示GmCBL6基因启动子中不仅存在TATA-box、CAAT-box核心启动子区域,还存在许多其他顺式作用元件,如干旱相关元件（MBS）、赤霉素响应元件（TATC-box和GARE-motif）、脱落酸响应元件（ABRE）、水杨酸诱导相关元件（TCA-element）、厌氧诱导相关元件（ARE）以及光调控有关元件（AMP-element和G-box）等。2.构建了GmCBL6基因全长启动子驱动的植物表达载体p BI121-PGmCBL6-0,并通过农杆菌介导法将p BI121-PGmCBL6-0转入野生型烟草植株。PCR鉴定结果显示,成功获得4株GmCBL6启动子融合gus报告基因的阳性转化植株。将转基因烟草植株进行高盐（400mmol/L Na Cl）和干旱（300mmol/L甘露醇）胁迫,分别于0、4、8、12、24 h进行GUS组织化学染色和GUS活性检测。GUS组织化学染色结果表明,GmCBL6基因启动子在这两种胁迫下的转基因烟草中能够驱动gus基因的表达,具有启动子活性,在胁迫12 h和24 h时启动子活性最强。GUS活性检测发现,转基因烟草在两种胁迫下4 h时与对照相比活性差别不大,随着胁迫处理时间的延长,GUS活性逐渐提高,在24 h时GUS活性达到峰值。因此,GmCBL6基因启动子是干旱和高盐胁迫诱导型启动子。3.根据GmCBL6基因启动子顺式元件的分布,分别扩增得到PGmCBL6-1（1269bp）、PGmCBL6-2（969bp）、PGmCBL6-3（769bp）和PGmCBL6-4（519bp）四个不同长度的5’缺失片段并构建植物表达载体,瞬时转化烟草。GUS组织化学染色结果表明,四个缺失片段均具有启动子活性,其中PGmCBL6-2片段活性最强,PGmCBL6-3片段活性最弱。经GUS活性检测发现,4个不同长度区的5’缺失片段的GUS活性有所不同,PGmCBL6-2驱动的gus基因表达活性最高,PGmCBL6-3启动活性最弱。综合以上结果推测在-969-769bp区域是GmCBL6基因启动子的核心功能区,这可能与该区域含有MYB、MRE和TC-rich repeats等响应元件相关。
彭亚男[3]（2021）在《大豆GmCBL7基因启动子的克隆与功能分析》文中研究表明在复杂的环境中植物需要在其整个生命周期中应对大量刺激,在这个过程中Ca2+是一种普遍存在的第二信使,在许多种细胞代谢过程中发挥作用从而响应植物的生物和非生物胁迫反应。类钙调神经磷酸酶B（CBL）蛋白作为钙感受器,能够感知逆境Ca2+信号并与Ca2+结合,进而激活其下游蛋白激酶CIPK,通过与CBL互作蛋白激酶（CIPKs）相互作用,在植物对各种非生物胁迫的响应和生长发育中发挥重要作用。在转录调控过程中,基因启动子及其顺式作用元件可以激活或抑制基因的表达。因此分析在转录水平上调节基因表达的启动子功能,对揭示基因在植物生长发育与逆境防御中的调控机制至关重要,并可以为植物的抗逆性品种改良提供依据。本研究从大豆中克隆GmCBL7基因启动子（Cbl P7-1）全长序列及其4个不同长度的5’端缺失片段。分别构建植物表达载体后稳定转化烟草和瞬时转化大豆毛状根,为GmCBL7基因启动子功能验证提供依据。本研究的主要研究结果如下:1.根据植物基因组数据库Phytozome中大豆GmCBL7基因上游序列设计引物,从大豆中克隆得到GmCBL7基因启动子序列,序列长度为1523bp,命名为Cbl P7-1。通过启动子在线分析软件PLACE和Plant CARE预测后发现在该序列中存在许多启动子核心元件,如与转录起始有关的TATA-box和与转录频率有关的CAAT-box。还存在一些与逆境胁迫和植物激素诱导相关的调控元件:HSE（高温响应元件）,MBS（干旱响应元件,结合MYB转录因子）,MYB（参与干旱、盐和ABA应答）,MYC（干旱和ABA响应元件）,ABRE（ABA应答相关元件）,ERE（乙烯应答相关元件）等,以及一些与光调控、胚乳形成相关、分生组织表达和损伤响应相关的顺式作用元件。预测结果表明GmCBL7基因启动子在逆境胁迫下可被诱导表达。同时构建了该启动子驱动的植物双元表达载体p CAMBIA1301-Cbl P7-1。2.通过农杆菌介导的叶盘法将启动子植物表达载体p CAMBIA1301-Cbl P7-1稳定转化烟草,获得2株Cbl P7-1融合gus报告基因的阳性转化植株。对转基因植株的根、茎、叶中的GUS活性分析结果表明,GmCBL7基因启动子在转基因植株中表现出不同的组织表达模式,特别是在茎中表达活性最强。GUS酶活测定结果表明,GmCBL7基因启动子参与调控大豆对高盐和干旱胁迫的应答。3.为了进一步研究GmCBL7基因启动子的核心调控区域,对该启动子进行5’端缺失分析,克隆了4个5’端缺失片段,序列长度分别为1202bp（Cbl P7-2）,902bp（Cbl P7-3）,454bp（Cbl P7-4）和251bp（Cbl P7-5）,并分别构建了5’端缺失片段驱动的植物双元表达载体,分别为p CAMBIA1301-Cbl P7-2、p CAMBIA1301-Cbl P7-3、p CAMBIA1301-Cbl P7-4和p CAMBIA1301-Cbl P7-5。4.利用农杆菌介导法将5种启动子植物表达载体分别对烟草和大豆毛状根进行瞬时转化,经过GUS组织化学染色后发现,全长片段Cbl P7-1（1523bp）和2个5’缺失片段Cbl P7-2（1202bp）,Cbl P7-3（902bp）具有启动活性,且Cbl P7-3启动活性最强;而Cbl P7-4（454bp）启动活性很弱,Cbl P7-5（251bp）无启动活性。推测该启动子核心调控区可能位于-1202～-454bp区域内。
陈佳静,李彤彤,张则,卢安然,李陈飞,冯秀丽[4]（2021）在《泛素化激酶Cbl蛋白对H9N2亚型禽流感病毒早期复制的抑制作用》文中研究指明为研究Cbl蛋白（Casitas b-lineage lymphoma）对H9N2亚型禽流感病毒（AIV）复制的影响,采用PCR技术扩增Cbl基因片段并连接到FLAG-N载体中,Western blot技术验证FLAG-Cbl重组载体表达及病毒NP蛋白的表达情况,并采用荧光定量PCR技术检测病毒的血凝素（HA）、核蛋白（NP）和非结构蛋白（NS）基因水平;采用RNAi技术检测Cbl对病毒HA基因表达水平的影响。结果显示:EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及测序分析发现,成功构建真核表达重组载体FLAG-Cbl; Western blot结果证实H9N2亚型AIV感染FLAG-Cbl重组载体转染的A549细胞6 h时,病毒NP蛋白表达降低;荧光定量PCR结果证实病毒NP、NS及HA基因在AIV感染FLAG-cbl重组载体转染的A549细胞的6和12 h时表达水平均明显降低;RNAi敲低A549细胞内源性Cbl蛋白后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12、24和36 h明显升高。结果表明:Cbl蛋白能在早期抑制H9N2亚型AIV在A549细胞上的复制,为深入研究Cbl蛋白抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗AIV的药物研发提供了参考。
黎梦娟,朱礼明,霍俊男,张景波,施季森,成铁龙[5]（2021）在《唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因克隆及表达分析》文中进行了进一步梳理【目的】唐古特白刺（Nitraria tangutorum）是土壤荒漠化和盐碱化防治的先锋植物,对高盐和干旱有极强的适应能力,植物CBL基因作为钙离子感受器,在植物逆境应答及发育过程中具有重要功能。以盐生植物唐古特白刺为材料,开展唐古特白刺CBL基因克隆及表达分析,以深入了解唐古特白刺的抗逆分子机制。【方法】根据唐古特白刺的转录组数据,设计特异性引物,克隆两个CBL基因,并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位鉴定。使用实时荧光定量PCR技术分析盐胁迫条件下唐古特白刺CBL基在叶片中的表达模式。【结果】克隆鉴定了唐古特白刺的NtCBL1、NtCBL2基因,NtCBL1基因cDNA编码区长度为642 bp,可编码213个氨基酸,蛋白质分子质量为52.77 ku,分子式为C1 971H3 302N642O836S106;NtCBL2基因cDNA编码区长度为681 bp,可编码226个氨基酸,蛋白质分子质量为26.10 ku,分子式为C1 179H1 832N298O356S7。亚细胞定位预测和鉴定结果显示NtCBL1、NtCBL2蛋白均定位于细胞膜上。在胁迫、干旱迫、冷胁迫处理下,NtCBL1、NtCBL2基因均表现出不同程度的变化,而NtCBL1基因的变化更为明显,推测其在盐、干旱胁迫中发挥重要作用。【结论】从唐古特白刺中克隆出NtCBL1、NtCBL2基因,发现NtCBL1基因在盐胁迫下表达量明显上升,而NtCBL2基因变化不大。结果表明NtCBL1基因可能参与唐古特白刺的盐、干旱胁迫响应,而NtCBL2基因在冷胁迫下起一定作用。
沈祥娟[6]（2020）在《大豆GmCBL7基因的克隆与功能分析》文中研究指明植物在长期的进化过程中,为了抵御不利环境的影响,逐渐形成了一套严密而又完善的信号传导系统。Ca2+是包括植物在内的所有真核生物的许多信号传导途径的通用第二信使。当植物遭受盐、干旱、氧化等胁迫时,胞质溶胶中的Ca2+浓度会在时空上发生显着的变化,这种变化被相应的Ca2+感受器感知,并进一步将信号传递至下游[1]。钙调磷酸酶B类蛋白（B-like protein,CBL）是植物体内的Ca2+感受器之一,它通过特异地与蛋白激酶CIPK（CBL interacting protein kinase,CIPK）互作来激活下游靶标,解码“Ca2+信号”[2],进而调节植物相关生理功能。CBL家族在许多模式植物中研究较为广泛,但目前对大豆CBL家族的研究不是特别深入。本研究以“黑农-44”为实验材料,从大豆中克隆了与拟南芥AtCBL2基因同源的GmCBL7基因序列,并构建了GmCBL7基因的植物表达载体,并将该基因成功转化到烟草中。对转基因植株进行抗逆性分析,确定了该基因与非生物胁迫耐受性的关系。获得的主要研究成果如下:1.大豆GmCBL7基因的克隆与序列分析根据拟南芥At CBL2蛋白序列在大豆基因组数据库（www.Phytozome.com/soybean）进行同源比对获得大豆同源序列GmCBL7,通过RT-PCR扩增获得GmCBL7基因序列964 bp,该序列CDS长度为672 bp,编码223个氨基酸。生物信息学分析表明,GmCBL7蛋白为亲水蛋白,具有典型的EF-Hand结构域,不存在跨膜结构域,不含有信号肽,属于非分泌性蛋白。亚细胞定位预测结果显示,该蛋白主要定位于细胞质中。系统进化分析表明,GmCBL7与豆科植物中的同源蛋白处于一个进化分支,且与木豆（Cajanus cajan）中同源蛋白的亲缘关系最近。2.大豆GmCBL7基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化利用In-fusion无缝连接酶通过同源重组的方法将GmCBL7基因连接至植物表达载体pCPB中,经菌落PCR和测序证明pCPB-GmCBL7植物表达载体构建成功。通过农杆菌介导的叶盘法转化野生烟草,获得了28株草丁膦抗性植株,PCR鉴定结果表明,15株为阳性植株。随机选取3株进行RT-PCR检测,结果均在转录水平获得表达。3.转GmCBL7基因烟草的抗逆性鉴定对野生型和转基因烟草进行了200 mmol/L NaCl和200 mmol/L甘露醇胁迫下的生理指标测定分析。结果表明,在高盐和干旱处理6 h和12 h后,转基因植株的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、脯氨酸含量均显着高于野生型,MDA含量均显着低于野生型,说明GmCBL7基因过表达能够提高转基因植株的抗旱耐盐能力。
孙启鑫[7]（2018）在《多靶点酪氨酸激酶抑制剂调控c-Cbl基因介导的急性髓系白血病细胞耐药性研究》文中研究说明背景及目的:急性白血病整体治疗效果目前仍不能令人满意,疾病复发与难治是影响疗效进一步提高的两个主要原因。当前分子遗传学异常导致的细胞内部信号转导紊乱被认为是导致急性白血病发病的主要因素,而能够靶向抑制疾病相关信号通路的激酶抑制剂类药物被认为是未来疗效突破的希望[1]。目前,以索拉非尼为代表的多靶点酪氨酸激酶抑制剂已经在难治复发型白血病患者中广泛应用,但患者间疗效存在明显差异,其中原因并不清楚。我们早期研究发现,药物靶点c-kit（CD1 17）高表达者,疗效优于低表达或无表达患者,似乎药物疗效与靶受体表达量密切相关。近年发现,生理状态下酪氨酸激酶信号存在激活与灭活,正负两个调控系统[2],而c-CBL蛋白被认为是酪氨酸激酶信号负性调控的核心[3],其表达下降将直接导致酪氨酸激酶型受体（如:c-kit）信号表达的增强[4]。为此,我们设想c-Cbl基因的表达与细胞耐药之间是否存在一定的联系?调节c-Cbl基因的表达,通过改变酪氨酸激酶正、负调节平衡,是否可以影响白血病细胞的耐药,并由此改变临床患者的疗效?为此,我们进行了c-Cbl基因功能状态与细胞耐药相关研究,并初步探讨了索拉非尼治疗与c-CBL蛋白及其相关信号通路间的关系。方法:1.定量PCR法检测难治、复发患者c-Cbl基因的基础表达2.基因重组技术分别构建可促使c-Cbl基因表达沉默慢病毒载体和过表达腺病毒载体,慢病毒和腺病毒包装,病毒颗粒感染HL60和THP1白血病细胞,定量PCR法和免疫印迹法检测c-Cbl基因在mRNA转录和蛋白翻译层面改变,验证慢病毒和腺病毒包装成功。3.慢病毒和腺病毒分别感染白血病细胞,感染后获得c-Cbl基因沉默和过表达细胞。以普通白血病细胞为对照,利用CCK-8法和台盼蓝拒染技术法检测三种细胞自身增殖、干细胞因子刺激后增殖以及药物敏感性方面的差异。流式细胞仪检测细胞周期以及各细胞对索拉非尼和阿糖胞苷凋亡诱导效应的差异4.免疫印迹检测索拉非尼处理前后,c-Cbl基因沉默、过表达和普通细胞内T-CBL、p-CBL、c-Kit（CD117）、PDGFRβ（CD140b）、MDR1、T-Akt、p-Akt、T-ERK、p-ERK蛋白表达变化。结果:1.难治复发型急性白血病患者普遍存在c-Cbl基因低表达现象2.成功构建并筛选出可以高效感染白血病细胞的慢病毒,病毒感染后,可成功筛选出HL60和THP1细胞c-Cbl基因稳定沉默株。与普通对照细胞相比,c-Cbl基因表达沉默细胞,自身增殖轻度增加,细胞s期比例下降,细胞对SCF刺激敏感性增高,对索拉非尼敏感性下降;索拉非尼和阿糖胞苷直接诱导的细胞凋亡减少。3.成功构建高效感染白血病细胞的腺病毒,病毒感染后,HL60和THP1细胞可检测出c-Cbl基因和蛋白瞬时高表达。与普通对照细胞相比,过表达细胞增殖下降,G2/M期比例下降,细胞对SCF刺激敏感性下降,对索拉非尼敏感性增强,索拉非尼和阿糖胞苷直接诱导的细胞凋亡增加。4.免疫印迹分析显示,索拉非尼处理可导致各细胞T-CBL和p-CBL蛋白均表达下调,c-kit和PDGFRβ不同程度表达上调,MDR1表达无明确影响。沉默c-Cbl基因表达,HL60细胞ERK和AKt双信号通路激活,THP1细胞AKt信号通路激活;c-Cbl基因过表达,两种细胞ERK和AKt通路均无激活。索拉非尼处理普通白血病细胞,HL60细胞ERK通路激活,THP1细胞AKt通路激活;索拉非尼处理c-Cbl基因沉默或过表达细胞株,均可检测到细胞ERK和AKt双信号通路激活。结论:1、c-Cbl基因普遍低表达可能与患者细胞耐药、疾病难治相关2、c-Cbl基因表达下调,细胞自身增殖、配体刺激的增殖增加;细胞对索拉非尼和阿糖胞苷耐药性增高。3、c-Cbl基因表达上调,细胞自身增殖、配体刺激的增殖下降;细胞对索拉非尼和阿糖胞苷敏感性增加。4.c-Cbl基因表达差异与白血病细胞耐药性相关;索拉非尼应用促使c-CBL蛋白表达下调,膜表面靶受体蛋白表达上调。强制改变c-Cbl基因表达,可促使细胞固有信号激活方式发生改变。Akt和ERK两个信号通路蛋白,同时参与了索拉非尼诱导的c-Cbl基因表达变化细胞内部信号的激活。5.以c-Cbl基因功能分析,索拉非尼加重细胞耐药发生,临床使用应谨慎选择适合人群。以临床实际效果分析,大部分患者仍有一定疗效,不排除另有其他通路和机制参与了细胞耐药发生。
梁静泊,高帅,申坤,李本睿,宗嫚嫚,郑阳,余远楠,谢金峰,冯秀丽[8]（2018）在《CBL蛋白的真核表达及其对日本脑炎病毒的抑制作用》文中认为CBL蛋白是一种E3泛素连接酶,在调控信号传导等方面发挥重要作用。采用PCR扩增CBL基因片段并连接到pEGFP-C1载体中,经Bam HⅠ、HindⅢ双酶切鉴定及基因测序,成功构建真核表达重组载体pEGFP-CBL。倒置荧光显微镜观察和Western blot结果证实,重组载体pEGFP-CBL在BHK-21细胞中成功表达。病毒增殖试验结果证实,日本脑炎病毒（JEV）强毒株感染转染pEGFP-CBL重组载体的BHK-21细胞,3 d内未见明显细胞病变。结果表明,真核表达载体pEGFP-CBL成功构建,且重组表达的CBL蛋白能够抑制早期JEV增殖,从而为深入研究CBL蛋白的免疫调节功能奠定了基础。
蔡琼[9]（2017）在《马尾松抗旱相关基因的克隆及表达分析》文中指出干旱是影响植物正常生长发育的重要逆境因子之一,直接影响林木正常代谢,导致植物细胞脱水,膜、酶系统遭到破坏,细胞功能丧失,进而导致林木代谢紊乱,影响林木产量和品质。马尾松是我国南方最主要的造林树种之一。截止目前,关于马尾松抗旱基因的基础性研究报道较少。因此,利用分子生物学手段,深入研究马尾松抗旱基因,探讨与揭示其抗旱机理和抗旱本质,进一步提高其抗旱能力,成为现代马尾松研究工作中急需解决的关键问题之一。本研究选用速生高抗旱马尾松优良家系83号（广西）1年生实生幼苗为供试材料,以期探究其在干旱胁迫中响应干旱的分子机理。主要研究内容与结果如下:（1）通过同源克隆技术从马尾松中获得APX、AQP、CBL、DHN、ERF、GPX、NAC、PEPC、POD 9个抗旱相关基因片段,初步证实了这些基因存在于马尾松中。然后利用RT-PCR及RACE技术克隆到7个马尾松干旱胁迫相关基因的cDNA全长,分别命名为PmNAC、PmERF、PmCBL3、PmDHN、PmGPX6、PmPIP1和PmPOD。生物信息学分析表明,PmNAC含NAM结构域,与北美云杉亲缘关系最近;PmERF含AP2-ERF结构域,与油松亲缘关系最近;PmCBL3含EF-hand结构域,与北美云杉亲缘关系最近;PmDHN含Dehydrin结构域,与中欧山松亲缘关系最近;PmGPX6含GSHPeroxidase结构域,与油松亲缘关系最近;PmPIP1含MIP保守区,与挪威云杉亲缘关系最近;PmPOD含Peroxidase结构域,与北美云杉亲缘关系最近。（2）通过对马尾松PmCBL3、PmDHN、PmGPX6、PmPIP1和PmPOD基因在干旱胁迫下不同组织和不同处理时期进行表达分析,结果表明,PmCBL3、PmDHN、PmGPX6、PmPIP1和PmPOD 5个基因在根、茎、叶中均受干旱诱导表达,并且在干旱胁迫下,呈先上升后下降的表达模式。推测基因可能参与马尾松干旱胁迫过程。同时克隆到马尾松PmACTIN内参基因片段。（3）根据基因酶切位点,共成功构建pBI121-PmPIP1、pSH737-PmCBL3、pBI121-PmGPX6、pBI121-PmPOD、pBI121-PmDHN 5个植物表达载体。为进一步通过基因遗传转化技术进行基因转化拟南芥奠定了基础。（4）采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得转PmGPX6（G1、G2、G4、G6、G7、G9）、PmPOD（P1、P2、P4、P5、P6）和PmDHN（D1、D3、D5、D7、D8、D10）的拟南芥株系。经抗旱性分析,结果表明:在含0%PEG 6000的条件下,转PmGPX6基因拟南芥与野生型拟南芥的表型与根长差异不大;在含3%的PEG 6000的条件下,两者表型差异不大,但野生型拟南芥根生长受到明显抑制,根的生长量明显降低。转PmGPX6基因拟南芥根系生长虽也受到干旱胁迫的抑制,但转PmGPX6基因拟南芥株系表现的干旱敏感程度明显低于野生型拟南芥,其根系远长于野生型拟南芥,两者间差异达到显着水平（P<0.05）。转基因拟南芥不定根在蓝色光激发下,发出强烈的绿色荧光,表明PmGPX6基因在转基因拟南芥根中实现了高效表达。在含0%PEG 6000的条件下,转PmPOD基因拟南芥植株与野生型拟南芥植株的表型与根长均无明显差异;在含4%的PEG 6000的条件下,两者表型差异不大,但转基因拟南芥的平均根较野生型拟南芥的平均根要长。转基因拟南芥不定根在蓝色光激发下,发出强烈的绿色荧光,表明PmPOD基因在转基因拟南芥根中实现了高效表达。干旱胁迫下,转PmPOD与野生型拟南芥叶片失水率均呈增长趋势,但转基因植株失水率低于野生型植株,呈显着差异（P<0.05）;转PmPOD拟南芥与野生型拟南芥脯氨酸含量均呈增长趋势,但转PmPOD拟南芥脯氨酸含量高于野生型植株;转PmPOD拟南芥与野生型拟南芥丙二醛含量均呈增长趋势,但转基因植株丙二醛含量低于野生型植株。野生与转基因拟南芥的脯氨酸、丙二醛含量均达显着差异水平（P<0.05）。在含0%PEG 6000的条件下,转PmDHN基因拟南芥与野生型拟南芥的表型与根长均无明显差异;在含3.5%的PEG 6000的条件下,两者表型差异不大,但转基因拟南芥的平均根较野生型拟南芥的平均根要长。RT-PCR分析结果显示:PmDHN基因能够在转基因拟南芥中转录,在干旱胁迫下转基因株系转录水平较正常水分条件的表达水平均有提高。Southern blot显示野生型拟南芥没有杂交信号,转基因株系（D1、D3）均为2个拷贝。转基因拟南芥不定根发出强烈的绿色荧光,表明PmDHN基因在转基因拟南芥根中实现了高效表达。干旱胁迫下,转PmDHN与野生型拟南芥叶片失水率均呈增长趋势,但转基因植株失水率低于野生型植株,呈显着差异（P<0.05）;转PmDHN拟南芥与野生型拟南芥脯氨酸含量均呈增长趋势,但转PmDHN拟南芥脯氨酸含量较野生型植株分别增加7.79%、15.79%;转PmDHN拟南芥与野生型拟南芥丙二醛含量均呈增长趋势,但转基因植株丙二醛含量较野生型植株分别降低了4.08%、11.52%。野生型与转基因拟南芥的脯氨酸、丙二醛含量均达显着差异水平（P<0.05）。（5）经表述分析与功能验证,PmAQP、PmCBL、PmDHN、PmERF、Pm GPX6、PmNAC、PmPEPC、PmPOD、PmACTIN基因已登录NCBI,PmGPX6、PmPOD、PmDHN基因具有抗旱功能。
马晶飞[10]（2015）在《小麦TaCIPK16基因的克隆、表达分析及遗传转化研究》文中提出近年来发现CBL蛋白（Calcineurin B-like protein）是植物所特有的一类Ca2+感受器,CIPK蛋白（CBL-interacting Protein Kinase）是与其相互作用的蛋白激酶,两者共同组成Ca2+-CBL-CIPK信号转导系统。CBL-CIPK系统在响应低温、干旱和高盐等非生物逆境胁迫以及ABA和乙烯等信号分子的转导中具有非常重要的作用。本实验在克隆小麦TaCIPK16基因cDNA全长序列的基础上主要进行了以下工作:（1）首先在数据库中搜索并拼接小麦TaCIPK16基因的ESTs序列,然后设计特异性RT-PCR引物,克隆得到TaCIPK16基因的cDNA全长。（2）通过TaCIPK16基因序列分析发现,编码蛋白TaCIPK16含有N端的激酶结构域、C端的NAF结构域和PPI结构域,属于SnRK3类激酶。通过序列比对以及进化树分析发现,该基因和OsCIPK16基因的同源性最高,因此将其命名为TaCIPK16基因。（3）利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）分析了TaCIPK16基因在NaCl、PEG、H?O?、4℃低温及ABA、ETH六种不同处理下的表达情况,结果表明TaCIPK16基因能够被NaCl、PEG、ETH、H?O?处理诱导表达,说明该基因可能参与了盐胁迫、干旱胁迫、乙烯胁迫和氧化胁迫信号转导,为逆境胁迫响应基因。（4）构建酵母表达载体pGADT7-TaCIPK16,利用酵母双杂交方法检测了TaCIPK16与TaCBLs在酵母体内的相互作用。结果显示TaCIPK16和目前已克隆的7个TaCBLs无相互作用。（5）构建小麦TaCIPK16基因的真核表达载体pBI121-TaCIPK16-GFP用于亚细胞定位分析和烟草的遗传转化。利用基因枪技术对重组质粒进行瞬时表达,结果表明TaCIPK16-GFP融合蛋白分布于细胞膜、细胞质和细胞核。利用农杆菌介导法将重组质粒pBI121-TaCIPK16-GFP转化到烟草中,通过组培技术获得转基因烟草阳性植株。本文的研究结果有助于进一步了解TaCIPK16基因在响应逆境胁迫的作用,为小麦抗逆分子育种研究与开发奠定基础。
二、人cbl基因真核表达载体的构建及表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人cbl基因真核表达载体的构建及表达（论文提纲范文）
（1）苹果棕榈酰转移酶基因MdPAT16促进糖分转运和增强耐盐性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 蛋白质的翻译后修饰形式 |
| 1.1.1 糖基化 |
| 1.1.2 磷酸化和泛素化 |
| 1.1.3 脂质链修饰以及棕榈酰化 |
| 1.2 不同物种中的棕榈酰基转移酶 |
| 1.2.1 酵母细胞中的棕榈酰基转移酶 |
| 1.2.2 植物中的棕榈酰基转移酶 |
| 1.3 棕榈酰化修饰的鉴定方法 |
| 1.3.1 酰基-生物素交换法(Acyl-Biotin Exchange,ABE) |
| 1.3.2 酰基-树脂辅助捕获(acyl-RAC)法 |
| 1.4 蛋白棕榈酰化的抑制 |
| 1.5 棕榈酰化与非生物胁迫 |
| 1.5.1 钙信号,CBLs与胁迫响应 |
| 1.5.2 糖与非生物胁迫 |
| 1.6 研究内容、目的及意义 |
| 第二章 苹果棕榈酰基转移酶MdPAT16 的表达分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 植物材料的获得以及处理方法 |
| 2.1.2 MdPATs家族的生物信息学分析 |
| 2.1.3 MdPATs家族对逆境胁迫的响应,以及表达模式分析 |
| 2.1.4 丙二醛含量以及超氧根阴离子含量测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 盐胁迫对植株糖含量影响 |
| 2.2.2 棕榈酰基转移酶MdPAT16 的确定 |
| 2.2.3 MdPAT16 的生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 苹果MdPAT16 基因的功能鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 MdPAT16 的获得 |
| 3.1.2 MdPAT16 的遗传转化 |
| 3.1.3 MdPAT16 蛋白的真核诱导 |
| 3.1.4 MdPAT16 棕榈酰化检测 |
| 3.1.5 MdPAT16 转基因苹果苗的盐处理 |
| 3.1.6 NaCl处理相关生理指标测定 |
| 3.1.7 糖含量测定 |
| 3.1.8 根长及根面积检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 MdPAT16 的基因克隆 |
| 3.2.2 MdPAT16 转基因材料获得 |
| 3.2.3 MdPAT16 过表达提高植株的盐抗性 |
| 3.2.4 MdPAT16 过表达提高植株的糖含量 |
| 3.2.5 MdPAT16 编码棕榈酰基转移酶蛋白 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 MdPAT16 通过与MdCBL1 互作调控苹果果实糖含量 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 免疫共沉淀(Co-IP)研究目的蛋白间互作 |
| 4.1.2 验证蛋白互作的In vitro pull down实验 |
| 4.1.3 验 证互 作的双分子荧光互 补实验 (Bimolecularfluorescence complementation assay,Bi FC) |
| 4.1.4 验证互作的分离荧光素酶实验(Dual-Luciferase assay) |
| 4.1.5 MdPAT16 的亚细胞定位 |
| 4.1.6 体外蛋白降解实验 |
| 4.1.7 病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)实验 |
| 4.1.8 酵母双杂交筛库 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 MdPAT16 与钙调磷酸酶B类蛋白MdCBL1 互作验证 |
| 4.2.2 MdCBL1 的棕榈酰化、亚细胞定位和蛋白稳定性 |
| 4.2.3 MdPAT16 通过MdCBL1 棕榈酰化调控糖含量 |
| 4.2.4 MdCIPK13参与到MdPAT16 介导的糖累积过程中 |
| 4.2.5 MdCBL1与Ring-HC domain E3 连接酶MdRHC1 互作 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）大豆GmCBL6基因启动子的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 启动子概述 |
| 1.2 启动子的结构和功能 |
| 1.2.1 核心启动子区 |
| 1.2.2 上游启动子区 |
| 1.3 启动子的类型 |
| 1.3.1 组成型启动子 |
| 1.3.2 组织特异型启动子 |
| 1.3.3 诱导型启动子 |
| 1.4 植物CBL基因家族的研究进展 |
| 1.4.1 CBL的结构 |
| 1.4.2 CBL-CIPK的作用机制 |
| 1.4.3 CBL-CIPK信号系统提高植物抗逆性 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 大豆GmCBL6 基因全长启动子克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 菌种与载体 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大豆GmCBL6 基因全长启动子的克隆 |
| 2.3.2 GmCBL6 基因全长启动子的生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 GmCBL6 基因全长启动子的克隆 |
| 2.4.2 GmCBL6 基因全长启动子的生物信息学分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 GmCBL6 基因全长启动子的功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 植物材料 |
| 3.2.2 菌种与载体 |
| 3.2.3 主要药品与仪器设备 |
| 3.2.4 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 GmCBL6 基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 3.3.2 重组植物表达载体转化农杆菌EHA105 |
| 3.3.3 GmCBL6 全长启动子对烟草的遗传转化 |
| 3.3.4 非生物胁迫下转基因烟草的GUS检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 GmCBL6 基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 3.4.2 重组植物表达载体p BI121-PGmCBL6-0 转化农杆菌的鉴定 |
| 3.4.3 转基因植株的PCR鉴定 |
| 3.4.4 GUS组织化学染色法验证启动子活性 |
| 3.4.5 GUS活性测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 GmCBL6 基因启动子5’端缺失片段的克隆与功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 菌种与载体 |
| 4.2.3 主要药品与仪器设备 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 引物设计 |
| 4.3.2 GmCBL6 基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 4.3.3 GmCBL6 基因启动子5’缺失片段植物表达载体的构建 |
| 4.3.4 重组植物表达载体转化农杆菌 |
| 4.3.5 启动子5’缺失片段瞬时转化烟草 |
| 4.3.6 GUS组织化学染色 |
| 4.3.7 GUS活性测定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 GmCBL6 基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 4.4.2 GmCBL6 基因启动子5’缺失片段植物表达载体的构建 |
| 4.4.3 启动子5’缺失片段重组植物表达载体转化农杆菌的鉴定 |
| 4.4.4 组织化学染色法鉴定启动子缺失体活性 |
| 4.4.5 GmCBL6 基因启动子5’缺失体驱动的GUS活性变化 |
| 4.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）大豆GmCBL7基因启动子的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物CBL-CIPK信号通路研究进展 |
| 1.1.1 CBL和 CIPK的结构和分类 |
| 1.1.2 CBL与 CIPK作用机制 |
| 1.1.3 CBL-CIPK信号通路在响应非生物胁迫中的作用 |
| 1.2 植物基因启动子的研究进展 |
| 1.2.1 启动子的结构 |
| 1.2.2 启动子的类型 |
| 1.3 发根农杆菌介导的毛状根转化 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 大豆GmCBL7 基因启动子全长序列的克隆及植物表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 大豆GmCBL7 基因全长启动子的克隆 |
| 2.2.3 GmCBL7 基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.2 GmCBL7 基因启动子全长序列生物信息学分析 |
| 2.3.3 GmCBL7 基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 大豆GmCBL7 基因启动子5’缺失片段的克隆及植物表达载体的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 GmCBL7 基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 3.2.3 GmCBL7 基因5’缺失启动子植物表达载体的构建 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GmCBL7 基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 3.3.2 GmCBL7 基因5’缺失启动子植物表达载体的构建 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 GmCBL7 基因全长启动子的功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 重组植物表达载体转化农杆菌EHA105 |
| 4.2.3 农杆菌介导的烟草遗传转化 |
| 4.2.4 非生物胁迫下转基因烟草的GUS检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组植物表达载体转化农杆菌的鉴定 |
| 4.3.2 转基因植株的鉴定 |
| 4.3.3 GmCBL7 基因启动子的组织特异性表达模式分析 |
| 4.3.4 GmCBL7 基因启动子的GUS活性测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 GmCBL7 基因启动子5’端缺失片段的功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与试剂 |
| 5.2.1 植物材料及菌株 |
| 5.2.2 实验仪器及试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 不同5’端缺失启动子片段植物表达载体转化发根农杆菌 |
| 5.3.2 农杆菌介导的烟草瞬时转化 |
| 5.3.3 发根农杆菌诱导大豆毛状根 |
| 5.3.4 大豆毛状根的GUS组织化学染色 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 重组植物表达载体转化农杆菌的鉴定 |
| 5.4.2 烟草GUS组织化学染色分析 |
| 5.4.3 毛状根GUS组织化学染色分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）泛素化激酶Cbl蛋白对H9N2亚型禽流感病毒早期复制的抑制作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、载体及细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 Cbl基因的扩增 |
| 1.4 重组质粒的构建 |
| 1.5 Western blot检测蛋白表达 |
| 1.6 RNA的提取及反转录 |
| 1.7 荧光定量PCR设计合成 |
| 1.8 荧光定量 PCR反应体系和程序 |
| 1.9 转染siRNA |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 真核重组表达载体 FLAG-Cbl 构建 |
| 2.2 Cbl蛋白对H9N2病毒在A549细胞中复制的影响 |
| 2.2.1 从蛋白水平上检测Cbl蛋白对病毒复制的影响 |
| 2.2.2 从mRNA水平上检测Cbl蛋白对病毒复制的影响 |
| 2.3 敲低内源性Cbl蛋白对H9N2病毒增殖的影响 |
| 3 讨论 |
（5）唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因克隆及表达分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与处理 |
| 1.2 唐古特白刺总RNA的提取和反转录 |
| 1.3 唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因的克隆 |
| 1.4 CBL基因的生物信息学分析 |
| 1.5 唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因的亚细胞定位 |
| 1.6 唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因的表达分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因的克隆 |
| 2.2 唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2序列的参数分析 |
| 2.3 NtCBL1、NtCBL2氨基酸序列的同源性比对和系统进化分析 |
| 2.4 唐古特白刺基因的亚细胞定位 |
| 2.5 唐古特白刺基因的表达分析 |
| 3 讨 论 |
（6）大豆GmCBL7基因的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物CBL基因家族的研究进展 |
| 1.1.1 CBL的结构特征 |
| 1.1.2 CIPK结构特征 |
| 1.1.3 CBL与 CIPK作用机制 |
| 1.2 CBL-CIPK信号系统在植物响应非生物胁迫中的作用 |
| 1.2.1 CBL-CIPK响应植物高盐胁迫 |
| 1.2.2 CBL-CIPK响应植物干旱胁迫 |
| 1.2.3 CBL-CIPK响应植物氧化胁迫 |
| 1.2.4 CBL-CIPK响应植物低钾胁迫 |
| 1.3 展望 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 大豆GmCBL7基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 GmCBL7基因的克隆 |
| 2.3.2 GmCBL7基因序列及蛋白理化性质分析 |
| 2.3.3 GmCBL7蛋白结构分析 |
| 2.3.4 GmCBL7蛋白的信号肽、跨膜结构域分析 |
| 2.3.5 GmCBL7蛋白系统进化分析 |
| 2.3.6 GmCBL7蛋白的亚细胞定位分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 GmCBL7基因对烟草的遗传转化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 植物表达载体p CPB-Gm CBL7 的构建及对农杆菌的转化 |
| 3.3.2 GmCBL7基因对烟草的遗传转化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 转基因烟草的抗逆性鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）多靶点酪氨酸激酶抑制剂调控c-Cbl基因介导的急性髓系白血病细胞耐药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 复发或难治急性白血病患者c-Cbl基因的表达 |
| 一、病例与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 c-Cbl基因沉默与白血病细胞生物学行为改变及其机制 |
| 一、试剂与器材 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 c-Cbl基因过表达与白血病细胞生物学行为改变及其机制 |
| 一、试剂与器材 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）CBL蛋白的真核表达及其对日本脑炎病毒的抑制作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 真核表达载体的p EGFP-CBL的构建 |
| 1.3 真核表达载体p EGFP-CBL转染BHK-21细胞及鉴定 |
| 1.4 真核表达重组蛋白CBL对JEV增殖的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CBL基因的克隆 |
| 2.2 重组克隆载体p MD18-T-CBL鉴定 |
| 2.3 真核重组表达载体p EGFP-CBL构建及鉴定 |
| 2.4 真核重组表达载体p EGFP-CBL表达及鉴定 |
| 2.5 鉴定p EGFP-CBL融合蛋白在细胞中的表达 |
| 2.6 p EGFP-CBL真核重组表达蛋白抑制JEV增殖 |
| 3 讨论 |
（9）马尾松抗旱相关基因的克隆及表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| summary |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 植物基因克隆的主要研究方法 |
| 1.2.1 基因文库 |
| 1.2.2 插入突变技术 |
| 1.2.3 图位克隆 |
| 1.2.4 生物芯片 |
| 1.2.5 电子克隆 |
| 1.2.6 基因差异表达技术 |
| 1.2.7 高通量测序技术 |
| 1.3 国内外林木抗旱研究现状 |
| 1.3.1 植物形态结构特征与抗旱性 |
| 1.3.2 干旱胁迫下植物生理生化变化 |
| 1.3.3 植物对干旱胁迫信号的感应和传导 |
| 1.3.4 干旱胁迫应答基因 |
| 1.3.4.1 耐旱相关的功能基因及蛋白 |
| 1.3.4.2 耐旱相关的调控基因及蛋白 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 1.5 研究目标和主要研究内容 |
| 1.5.1 研究目标 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.6 研究技术路线 |
| 第二章 马尾松抗旱基因的DNA片段克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料与试剂 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 马尾松基因组DNA的提取 |
| 2.1.2.2 抗旱基因的PCR引物设计 |
| 2.1.2.3 抗旱基因片段的克隆 |
| 2.1.3 生物信息学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 马尾松基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 APX基因的克隆及分析 |
| 2.2.3 AQP基因的克隆及分析 |
| 2.2.4 CBL基因的克隆及分析 |
| 2.2.5 DHN基因的克隆及分析 |
| 2.2.6 ERF基因的克隆及分析 |
| 2.2.7 GPX基因的克隆及分析 |
| 2.2.8 NAC基因的克隆及分析 |
| 2.2.9 PEPC基因的克隆及分析 |
| 2.2.10 POD基因的克隆及分析 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 2.3.1 讨论 |
| 2.3.2 小结 |
| 第三章 抗旱相关基因的全长序列克隆及序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料与试剂 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.2.1 RNA的提取 |
| 3.1.2.2 引物设计与基因全长扩增 |
| 3.1.3 序列分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 RNA的提取 |
| 3.2.2 NAC基因的全长克隆及分析 |
| 3.2.2.1 5′-RACE扩增 |
| 3.2.2.2 3′-RACE扩增 |
| 3.2.2.3 NAC基因全长序列拼接 |
| 3.2.2.4 NAC蛋白质特征分析 |
| 3.2.3 ERF基因的全长克隆及分析 |
| 3.2.3.1 5′-RACE扩增 |
| 3.2.3.2 3′-RACE扩增 |
| 3.2.3.3 ERF基因全长序列拼接 |
| 3.2.3.4 ERF蛋白质特征分析 |
| 3.2.4 CBL基因的全长克隆及分析 |
| 3.2.4.1 5′-RACE扩增 |
| 3.2.4.2 3′-RACE扩增 |
| 3.2.4.3 CBL基因全长序列拼接 |
| 3.2.4.4 CBL蛋白质特征分析 |
| 3.2.5 DHN基因的全长克隆及分析 |
| 3.2.5.1 5′-RACE扩增 |
| 3.2.5.2 3′-RACE扩增 |
| 3.2.5.3 DHN基因全长序列拼接 |
| 3.2.5.4 DHN蛋白质特征分析 |
| 3.2.6 GPX基因的全长克隆及分析 |
| 3.2.6.1 5′-RACE扩增 |
| 3.2.6.2 3′-RACE扩增 |
| 3.2.6.3 GPX基因全长序列拼接 |
| 3.2.6.4 GPX蛋白质特征分析 |
| 3.2.7 AQP基因的全长克隆及分析 |
| 3.2.7.1 5′-RACE扩增 |
| 3.2.7.2 3′-RACE扩增 |
| 3.2.7.3 AQP基因全长序列拼接 |
| 3.2.7.4 AQP蛋白质特征分析 |
| 3.2.8 POD基因的全长克隆及分析 |
| 3.2.8.1 5′-RACE扩增 |
| 3.2.8.2 3′-RACE扩增 |
| 3.2.8.3 POD基因全长序列拼接 |
| 3.2.8.4 POD蛋白质特征分析 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 3.3.1 讨论 |
| 3.3.2 小结 |
| 第四章 抗旱基因在干旱胁迫下的表达分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料与试剂 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.2.1 材料的处理 |
| 4.1.2.2 RNA的处理 |
| 4.1.2.3 PmACTIN基因的克隆 |
| 4.1.2.4 抗旱相关基因引物设计 |
| 4.1.2.5 半定量RT-PCR体系的建立 |
| 4.1.2.6 半定量RT-PCR检测抗旱相关基因的组织分布 |
| 4.1.2.7 Real-Time PCR扩增体系及程序 |
| 4.1.2.8 Real-Time PCR扩增效率 |
| 4.1.2.9 基因相对表达量的分析方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 内参PmACTIN基因的克隆 |
| 4.2.2 RNA的提取与检测 |
| 4.2.3 半定量RT-PCR体系的建立 |
| 4.2.4 组织分布 |
| 4.2.5 扩增效率 |
| 4.2.6 溶解曲线 |
| 4.2.7 抗旱相关基因的Real-Time PCR扩增 |
| 4.2.8 待测基因在干旱处理下的表达谱分析 |
| 4.2.8.1 PmPOD基因的表达谱 |
| 4.2.8.2 PmDHN基因的表达谱 |
| 4.2.8.3 PmPIP1基因的表达谱 |
| 4.2.8.4 PmGPX6基因的表达谱 |
| 4.2.8.5 PmCBL3基因的表达谱 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 4.3.1 讨论 |
| 4.3.2 小结 |
| 第五章 马尾松抗旱相关基因植物表达载体构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 材料 |
| 5.1.1.2 菌株及载体 |
| 5.1.1.3 试验中所用试剂盒与药品 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 植物表达载体的构建 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 PmPIP1基因植物表达载体构建 |
| 5.2.1.1 PmPIP1基因全长的克隆 |
| 5.2.1.2 植物表达载体pBI121-PmPIP1的构建 |
| 5.2.1.3 植物表达载体pBI121-PmPIP1转入农杆菌检测 |
| 5.2.2 PmCBL3基因植物表达载体构建 |
| 5.2.2.1 PmCBL3基因全长的克隆 |
| 5.2.2.2 植物表达载体pSH737-PmCBL3的构建 |
| 5.2.2.3 植物表达载体pSH737-PmCBL3转入农杆菌检测 |
| 5.2.3 PmGPX6基因植物表达载体构建 |
| 5.2.3.1 PmGPX6基因全长的克隆 |
| 5.2.3.2 植物表达载体pBI121-PmGPX6的构建 |
| 5.2.4 PmPOD基因植物表达载体构建 |
| 5.2.4.1 PmPOD基因全长的克隆 |
| 5.2.4.2 植物表达载体pBI121-PmPOD的构建 |
| 5.2.4.3 植物表达载体pBI121-PmPOD转入农杆菌检测 |
| 5.2.5 PmDHN基因植物表达载体构建 |
| 5.2.5.1 PmDHN基因全长的克隆 |
| 5.2.5.2 植物表达载体pBI121-PmDHN的构建 |
| 5.2.5.3 植物表达载体pBI121-PmDHN转入农杆菌检测 |
| 5.3 讨论与小结 |
| 第六章 转基因植株的抗旱性分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.1.1 植物材料 |
| 6.1.1.2 菌株及载体 |
| 6.1.1.3 试验中所用试剂盒与药品 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.1.2.1 过表达载体的拟南芥转化 |
| 6.1.2.2 转基因拟南芥的抗旱表型分析 |
| 6.1.2.3 转基因拟南芥不定根GFP荧光检测 |
| 6.1.2.4 Southern blot分析 |
| 6.1.2.5 生理指标测定 |
| 6.1.2.6 数据统计分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 转PmGPX6拟南芥抗旱性分析 |
| 6.2.1.1 转PmGPX6基因拟南芥的获得与检测 |
| 6.2.1.2 转PmGPX6拟南芥的抗旱性鉴定 |
| 6.2.2 转PmPOD拟南芥抗旱性分析 |
| 6.2.2.1 转PmPOD基因拟南芥的获得与检测 |
| 6.2.2.2 转PmPOD基因拟南芥的抗旱性鉴定 |
| 6.2.3 转PmDHN拟南芥抗旱性分析 |
| 6.2.3.1 转PmDHN拟南芥的获得与检测 |
| 6.2.3.2 转PmDHN基因拟南芥的抗旱性鉴定 |
| 6.3 讨论与小结 |
| 6.3.1 讨论 |
| 6.3.2 小结 |
| 第七章 研究结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（10）小麦TaCIPK16基因的克隆、表达分析及遗传转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 植物CBL和CIPK家族概述 |
| 1.2 CBL-CIPK信号系统与植物逆境胁迫 |
| 1.3 研究内容及技术路线 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 TaCIPK16基因的克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 3 TaCIPK16基因的表达分析 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 4 TaCIPK16与TaCBLs的互作研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 5 TaCIPK16的亚细胞定位分析 |
| 5.1 实验材料和仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 6 烟草的遗传转化 |
| 6.1 实验仪器和材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 7 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、人cbl基因真核表达载体的构建及表达（论文参考文献）
- [1]苹果棕榈酰转移酶基因MdPAT16促进糖分转运和增强耐盐性机理研究[D]. 姜翰. 西北农林科技大学, 2021
- [2]大豆GmCBL6基因启动子的克隆及功能分析[D]. 李静. 哈尔滨师范大学, 2021(08)
- [3]大豆GmCBL7基因启动子的克隆与功能分析[D]. 彭亚男. 哈尔滨师范大学, 2021(08)
- [4]泛素化激酶Cbl蛋白对H9N2亚型禽流感病毒早期复制的抑制作用[J]. 陈佳静,李彤彤,张则,卢安然,李陈飞,冯秀丽. 畜牧与兽医, 2021(06)
- [5]唐古特白刺NtCBL1、NtCBL2基因克隆及表达分析[J]. 黎梦娟,朱礼明,霍俊男,张景波,施季森,成铁龙. 南京林业大学学报(自然科学版), 2021(03)
- [6]大豆GmCBL7基因的克隆与功能分析[D]. 沈祥娟. 哈尔滨师范大学, 2020(01)
- [7]多靶点酪氨酸激酶抑制剂调控c-Cbl基因介导的急性髓系白血病细胞耐药性研究[D]. 孙启鑫. 南方医科大学, 2018(09)
- [8]CBL蛋白的真核表达及其对日本脑炎病毒的抑制作用[J]. 梁静泊,高帅,申坤,李本睿,宗嫚嫚,郑阳,余远楠,谢金峰,冯秀丽. 畜牧与兽医, 2018(01)
- [9]马尾松抗旱相关基因的克隆及表达分析[D]. 蔡琼. 贵州大学, 2017(02)
- [10]小麦TaCIPK16基因的克隆、表达分析及遗传转化研究[D]. 马晶飞. 华中科技大学, 2015(06)