Brd4通过募集P-TEFb调控3T3-L1细胞分化

论文摘要

Brd4是溴结构域BET蛋白家族中的一员,含有两个N端溴结构域,可以特异性结合乙酰化的组蛋白,作为支架结构募集转录因子、染色质重塑因子、去甲基化酶等调控基因转录,Brd4还参与细胞周期的调控及超级增强子的形成等。此外,Brd4最重要的功能是与正性转录延伸因子P-TEFb形成Brd4/P-TEFb复合物,调控基因的转录延伸。正性转录延伸因子P-TEFb由催化亚基CDK9和调节亚基CyclinT组成,是一个具有激酶活性的异源二聚体,P-TEFb可以通过其磷酸化功能解除转录暂停,起到转录延伸暂停释放（pausing release）作用,从而使转录过程顺利完成,调控细胞内约70%的基因转录,是全局性的转录延伸因子。本实验室前期初探及相关文献报道,Brd4蛋白在脂肪细胞分化中有一定的影响,但是具体机制还不太清楚。3T3-L1前脂肪细胞是体外分化常用的经典模型,可以用来研究脂肪细胞的分化如:细胞形态变化、脂滴形成情况、分化相关基因及转录因子的表达等,探索出脂肪细胞分化原理,从而治疗脂肪细胞过度分化引起的肥胖,肥胖性疾病等。脂肪细胞分化本质是基因的选择性表达,由基因转录与表观遗传共同完成。目前研究3T3-L1细胞分化主要集中在表观遗传调控层面,而本文以基因转录延伸过程中的转录暂停释放pausing release作为切入点,对脂肪细胞分化进行初步探索。我们使用经典分化模型3T3-L1细胞,采用“鸡尾酒”法诱导其分化,探索两种转录延伸因子Brd4及P-TEFb对3T3-L1细胞分化的影响。本研究通过基因敲除,药物处理、油红染色、qRT-PCR、免疫共沉淀等技术和方法,发现:（1）转录因子Brd4促进3T3-L1细胞分化;（2）正性转录延伸因子P-TEFb促进3T3-L1细胞分化;（3）Brd4通过募集P-TEFb影响3T3-L1细胞分化,上述研究结果从pausing release层面揭示了 Brd4及P-TEFb两种转录延伸因子对脂肪细胞分化的影响,初步建立了转录延伸暂停释放在分化过程中的生物学意义,为今后研发药物治疗肥胖及肥胖相关疾病提供更多理论基础。

论文目录

• 英文缩略对照表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1. 细胞分化
•     1.1.1. 细胞分化概念、类型及意义
•     1.1.2. 脂肪细胞分化
•     1.1.3. 3T3-L1细胞分化
•     1.1.4. 3T3-L1细胞分化基础转录因子
•     1.1.5. PPARγ和C/EBPα在脂肪细胞分化中的核心作用
•     1.1.6. 3T3-L1细胞分化Marker蛋白
•     1.1.7. 表观遗传与细胞分化
•   1.2. Brd4结构功能及活性调控方式
•     1.2.1. Brd4结构及抑制剂JQ1的作用原理
•     1.2.2. Brd4的功能
•       1.2.2.1. Brd4与转录因子直接作用调控基因转录
•       1.2.2.2. Brd4在细胞周期中的作用
•       1.2.2.3. Brd4维持染色质构型
•       1.2.2.4. Brd4参与形成super enhancer调控基因转录
•       1.2.2.5. Brd4募集组蛋白修饰酶调控表观遗传
•       1.2.2.6. Brd4与疾病的发生
•     1.2.3. Brd4活性调控机制
•   1.3. RNA聚合酶Ⅱ及正性转录延伸因子b（P-TEFb）
•     1.3.1. RNA聚合酶Ⅱ（RNA PolⅡ）的结构
•     1.3.2. RNA PolⅡ CTD的活性调控
•     1.3.3. 正性转录延伸因子b（P-TEFb）的结构、功能及活性调控方式
•       1.3.3.1. P-TEFb的发现
•       1.3.3.2. P-TEFb的结构
•       1.3.3.3. P-TEFb的功能
•       1.3.3.4. P-TEFb的存在形式及活化方式
•   1.4. 研究内容及意义
•     1.4.1.研究内容
•     1.4.2. 研究意义
• 第二章 实验材料与方法
•   2.1. 实验材料与仪器
•     2.1.1. 感受态、细胞株及质粒
•     2.1.2. 主要药品、试剂和材料
•     2.1.3. 主要实验仪器和耗材
•   2.2. 常用溶液配方
•     2.2.1. 质粒转化培养相关溶液
•     2.2.2. 质粒DNA制备与克隆相关溶液
•     2.2.3. 细胞培养及细胞实验相关溶液
•   2.3. 实验方法
•     2.3.1. 普通PCR反应
•     2.3.2. 琼脂糖胶回收DNA片段（玻璃奶回收法）
•     2.3.3. DNA连接
•     2.3.4. E.coli感受态细胞制备
•     2.3.5. 质粒转化
•     2.3.6. 小量提取质粒DNA（小提）
•     2.3.7. DNA限制性内切酶酶切
•     2.3.8. 琼脂糖凝胶电泳
•     2.3.9. 质粒中量提取
•     2.3.10. shRNA构建
•     2.3.11. 细胞培养
•     2.3.12. 病毒包装感染
•     2.3.13. 细胞瞬时转染
•     2.3.14. 细胞药物处理
•     2.3.15. 药物诱导3T3-L1细胞分化
•     2.3.16. 核分级分离实验
•     2.3.17. 免疫共沉淀
•     2.3.18. 蛋白免疫印记
•     2.3.19. 总RNA提取
•     2.3.20. 逆转录PCR
•     2.3.21. 荧光实时定量PCR（qRT-PCR）
•     2.3.22. 细胞油红染色（oil red O）
•   2.4 本文qRT-PCR所用引物如下
• 第三章 结果与讨论
•   3.1. JQ1抑制3T3-L1细胞分化
•   3.2. 100nM JQ1对3T3-L1分化基因表达的影响
•   3.3. Brd4促进3T3-L1细胞分化
•   3.4. FVP抑制3T3-L1细胞脂滴生成
•   3.5. FVP抑制3T3-L1细胞分化基因表达
•   3.6. CDK9对3T3-L1细胞分化的影响
•   3.7. 小分子多肽T186E-20aa抑制3T3-L1细胞分化
•   3.8. 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵巧宣

导师: 陈瑞川

关键词: 细胞分化

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 厦门大学

分类号: R329.2

DOI: 10.27424/d.cnki.gxmdu.2019.000300

总页数: 87

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