嗜热网球菌纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达、发酵优化及应用研究

论文摘要

乳果糖是一种功能性二糖,成品为黄色澄清液体,其甜度略低于蔗糖,由于其重要的生理和药理功能,被广泛应用于食品、制药以及饲料加工等行业。生物酶法制备乳果糖反应条件温和,适应低碳经济和绿色环保的要求,逐渐成为研究热点。纤维二糖差向异构酶（CEase）属于N-乙酰-D-葡糖胺-2-差向异构酶（AGEs）超家族,能够催化β-1,4-糖苷键连接的寡糖还原末端的D-葡萄糖残基异构化为D-果糖残基从而生成乳果糖。本研究将来源于嗜热网球菌（Dictyoglomus thermophilum）的纤维二糖异构酶基因ce在枯草芽孢杆菌中成功表达,探究了重组酶的酶学性质,并通过摇瓶和3-L发酵罐优化实现了CEase的高效表达。最后进一步研究了利用重组酶制备乳果糖的条件,为生物酶法生产乳果糖奠定了基础。主要研究结果如下:（1）将纤维二糖差向异构酶基因ce与表达载体pBSMuL3连接,并转化至B.subtilis CCTCC M 2016536中得到重组菌B.subtilis/pBSMuL3-ce。重组菌在摇瓶发酵48 h后,胞内酶活达到了7.5 U·mL-1,SDS-PAGE显示在43 kDa处出现目的条带,表明来源于嗜热网球菌（D.thermophilum）的纤维二糖差向异构酶基因在B.subtilis中成功表达。随后进一步考察了重组CEase的酶学性质。结果表明该酶的最适pH值为8.5;最适温度为85℃,在pH8.5条件下,其85℃的半衰期为120 min。（2）为了提高重组酶的表达量,在摇瓶中探究重组菌产CEase的发酵条件。结果表明:最适培养基为甘油5 g·L-1,豆粕粉35 g·L-1,1 mM Ca2+,K2HPO4·3H2O 16.43 g·L-1,KH2PO42.31 g·L-1,此时重组酶胞内酶活达到12.13 U·mL-1;比较了无机氮源和有机氮源对发酵的影响,随后探究了不同碳源、恒流补料和梯度补料、补料C/N、发酵温度对重组菌生长和产酶的影响,结果表明以100 g?L-1葡萄糖、60 g·L-1大豆蛋白胨、175 g·L-1豆粕粉为补料培养基,补料C/N为2:1,发酵温度33℃,胞内酶活力最终能达到70.6 U?mL-1,是摇瓶优化前的9.35倍。（3）研究了不同反应温度,初始反应pH,底物浓度,反应时间,加酶量对重组CEase制备乳果糖的影响。结果表明最适酶转化条件为:反应温度90℃,初始反应pH8.5,底物浓度为400 g·L-1,加酶量30 U·mL-1,反应4 h时乳果糖产率最高,可达60.2%,此时产物中依匹乳糖的含量也达到最低为7.8%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 乳果糖概述
•     1.1.1 乳果糖的理化性质
•     1.1.2 乳果糖的功能与应用
•     1.1.3 乳果糖的市场
•     1.1.4 乳果糖的制备工艺
•   1.2 纤维二糖差向异构酶的概述
•     1.2.1 纤维二糖差向异构酶的结构
•     1.2.2 纤维二糖差向异构酶的催化机理
•     1.2.3 纤维二糖差向异构酶的制备
•     1.2.4 纤维二糖差向异构酶制备乳果糖的研究
•   1.3 枯草芽孢杆菌表达系统的介绍
•     1.3.1 枯草芽孢杆菌表达系统简介
•     1.3.2 枯草芽孢杆菌的高密度发酵
•   1.4 本课题立题依据和意义
•   1.5 本论文的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌种与质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 主要培养基
•   2.2 分子操作方法
•     2.2.1 目的基因的合成
•     2.2.2 PCR扩增获取目的基因与目标载体
•     2.2.3 重组质粒的构建与转化
•     2.2.4 E.coli JM109 感受态的制备
•     2.2.5 E.coli JM109 感受态细胞的转化
•     2.2.6 重组质粒的提取
•     2.2.7 胶回收目的DNA片段
•     2.2.8 琼脂糖凝胶电泳
•     2.2.9 聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）
•     2.2.10 目的基因片段与表达载体的连接
•     2.2.11 B.subtilis感受态细胞的制作和电转化方法
•   2.3 发酵培养方法
•     2.3.1 重组枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵
•     2.3.2 重组枯草芽孢杆菌的3-L罐发酵
•   2.4 分析方法
•     2.4.1 菌体浓度的测定
•     2.4.2 重组酶的分离纯化
•     2.4.3 蛋白浓度的测定
•     2.4.4 重组纤维二糖差向异构酶活力的测定
•     2.4.5 重组纤维二糖差向异构酶酶学性质研究
•     2.4.6 发酵液中葡萄糖浓度的测定
•     2.4.7 发酵液中残氮的测定
•   2.5 乳果糖的酶转化工艺
•     2.5.1 乳果糖的制备
•     2.5.2 乳果糖的检测
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的的克隆表达及酶学性质研究
•     3.1.1 重组CEase基因工程菌的构建
•     3.1.2 重组CEase的蛋白纯化
•     3.1.3 重组CEase的酶学性质探究
•   3.2 纤维二糖差向异构酶在枯草芽孢杆菌CCTCC M2016536 中的发酵优化
•     3.2.1 重组菌B.subtilis/pBSMuL3-ce的摇瓶发酵优化
•     3.2.2 重组菌B.subtilis/pBSMuL3-ce的3-L罐发酵优化
•   3.3 纤维二糖差向异构酶在制备乳果糖中的应用
•     3.3.1 反应温度对制备乳果糖的影响
•     3.3.2 反应pH对制备乳果糖的影响
•     3.3.3 反应时间对制备乳果糖的影响
•     3.3.4 加酶量对制备乳果糖的影响
•     3.3.5 底物浓度对制备乳果糖的影响
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王鑫淼

导师: 吴敬

关键词: 纤维二糖差向异构酶,克隆表达,枯草芽孢杆菌,发酵优化,乳果糖

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: Q78;TQ925

总页数: 52

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