敲除/过表达npm1重组慢病毒载体的构建及其对PCV2复制影响

论文摘要

(目的)本研究旨在明确宿主细胞核仁磷酸蛋白1型（Nucleophosmin 1,NPM1）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）复制的影响,为进一步研究NPM1在PCV2复制过程中的作用及机制奠定基础。（方法）本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得用于敲除npm1的重组慢病毒载体,与此同时克隆宿主细胞npm1基因,构建过表达npm1的重组慢病毒载体。随后通过包装慢病毒的方法,分别获得npm1过表达和敲除的慢病毒。再用上述慢病毒分别感染PK-15后分别用嘌呤霉素和G418进行筛选获得npm1敲除及过表达的PK-15细胞系,然后通过测序及Western blot进行鉴定。最后用PCV2感染野生型、npm1敲除及过表达的PK-15,荧光定量PCR法检测感染后24 h、48 h和72 h PCV2的病毒粒子拷贝数。（结果）基因组测序及Western blot鉴定结果均表明,本试验成功获得npm1敲除及过表达的PK-15。荧光定量PCR检测结果表明,与野生型PK-15相比,在感染后24 h,npm1敲除及过表达的PK-15中PCV2拷贝数未发生显著变化（p> 0.05）,而在感染后48 h和72h,npm1敲除的PK-15中的PCV2拷贝数显著下降（p <0.05）;在感染后72 h,npm1过表达的PK-15中PCV2拷贝数显著升高（p <0.05）。（结论）以上结果提示宿主细胞蛋白NPM1能够促进PCV2的复制。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 病毒与细胞
•     1.1.2 载体和菌株
•     1.1.3 主要试剂
•   1.2 方法
•     1.2.1 重组慢病毒载体的构建及鉴定
•     1.2.2 重组慢病毒的包装
•     1.2.3 基因敲除细胞的筛选与鉴定
•     1.2.4 基因敲除细胞的鉴定
•     1.2.5 npm1基因真核表达载体的构建
•     1.2.6 npm1基因过表达细胞的筛选及鉴定。
•     1.2.7 npm1基因敲除及过表达对PCV2复制的影响
•     1.2.8 胞浆与胞核蛋白的抽提
• 2 结果
•   2.1 重组慢病毒载体的构建及鉴定
•   2.2 慢病毒滴度测定
•   2.3 PK-15细胞npm1基因敲除鉴定
•   2.4 npm1基因敲除的PK-15细胞形态及生长活性
•   2.5 npm1基因真核表达载体的构建与鉴定
•   2.6 npm1基因真核表达
•   2.7 npm1基因敲除对PCV2复制的影响
•   2.8 npm1基因过表达对PCV2复制的影响
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 国内会议

作者: 韩聪,黄勇,童德文

关键词: 核仁磷酸蛋白型,猪圆环病毒型,复制

来源: 中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十五次学术交流会、中国病理生理学会动物病理学专业委员会第二十四次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第四次学术研讨会、中国兽医病理学家第四次研讨会 2019-07-27

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学动物医学院

分类号: S852.651

页码: 507-520

总页数: 14

文件大小: 1570k

下载量: 49