基于四环素调控系统构建白蛋白启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体

论文摘要

基于四环素调控系统构建白蛋白（albumin,Alb）启动子调控大鼠uPA（urokinase-type plasminogen activator,ruPA）转基因肝特异性过表达的慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP（pLATTRUTG）。以CTG0875-2-11质粒为模板,PCR扩增大鼠的uPA（ruPA）基因,3’端添加Flag标签,In-Fusion克隆至pLVX-Alb-TetOne-TRE-T2A-CopGFP（pLATTTG）质粒中,得到慢病毒载体pLVX-Alb-TetOne-TRE-ruPA-T2A-CopGFP（pLATTRUTG）,所构建质粒经测序和酶切鉴定。将pLATTRUTG瞬时转染293T细胞,转染后24 h倒置荧光显微镜检测CopGFP表达;接着向6孔细胞培养板内加入强力霉素（Doxycycline,Dox）,48 h后在倒置荧光显微镜下观察CopGFP表达（包括未加Dox的孔）,随后收集细胞以提取总RNA和总蛋白,用于RT-qPCR检测ruPA及报告基因表达和Western blot检测标签蛋白Flag表达。酶切和测序确证我们成功构建了慢病毒载体pLATTRUTG;瞬转293T细胞后,24 h倒置荧光显微镜下可见零星细胞（约占0.1%）发弱的绿色荧光,加Dox 48 h后所有细胞展现强的绿色荧光,而不加Dox的孔内仍然只见到零星细胞（约占0.1%）发弱的绿色荧光。RT-qPCR和Western blot检测结果显示,与不加Dox的细胞相比,加Dox的细胞中ruPA、报告基因CopGFP和Flag表达水平显著升高。结果提示,成功基于四环素调控系统构建Alb启动子调控大鼠uPA转基因表达的慢病毒载体pLATTRUTG,为相关后续实验奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 主要试剂
•     1.1.2 载体
•     1.1.3 细胞
•   1.2 方法
•     1.2.1 基于四环素调控系统构建Alb启动子调控大鼠uPA转基因肝特异表达的慢病毒载体pLATTRUTG构建
•     1.2.2 慢病毒载体pLATTRUTG体外功能验证
• 2 结果
•   2.1 慢病毒表达载体pLATTRUTG构建和鉴定
•   2.2 pLATTRUTG瞬转细胞
•   2.3 瞬时转染质粒pLATTRUTG的细胞中CopGFP、ruPA和Flag表达情况
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张晟,黎海燕,廉梅,刘宇,肖东,林晓琳

关键词: 白蛋白启动子,大鼠尿激酶,桡足类绿色荧光蛋白,四环素调控系统,慢病毒载体

来源: 动物医学进展 2019年08期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 南方医科大学基础医学院细胞生物学教研室,南方医科大学实验动物中心,南方医科大学基础医学院肿瘤研究所

基金: 国家自然科学基金项目(81600488),广东省科技计划项目(2017A010105017)

分类号: Q78

DOI: 10.16437/j.cnki.1007-5038.2019.08.003

页码: 29-33

总页数: 5

文件大小: 1662K

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