全文摘要
本发明提供了一种花生植株再生方法，使用该方法可以缩短获得再生苗的时间。所述方法的主要步骤是：将消毒并清洗后的花生种子的每片子叶从靠近子叶节的位置横切下1\/5~1\/3放入添加2,4‑D和TDZ的丛生芽点诱导培养基上，培养2周后将形成丛生芽点的子叶节外植体，转移到添加TDZ的植株再生培养基上得到再生植株，以再生植株作为接穗，珍珠岩中无菌萌发的花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接，经炼苗后移栽塑料大棚、温室或田间。本发明以花生子叶节作为外植体，子叶节部位内原激素水平较高，分化能力强，不但植株再生频率高，并且植株再生快，操作简便，节省大量人力物力财力。
主设计要求
1.一种花生植株再生方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）制备丛生芽点诱导培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加0.1～0.2mg\/L的TDZ和1～3mg\/L的2,4-D制成丛生芽点诱导培养基；制备植株再生培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加0.01～0.05mg\/L的TDZ制成植株再生培养基；（2）选择外植体材料：花生种子去种胚后的子叶节为外植体材料；（3）丛生芽点诱导及植株再生：a将花生种子进行消毒，用无菌水清洗后，将种子浸泡在无菌水中；b从无菌水中取出种子剥去种皮，去除种胚，从子叶上靠近子叶节的位置横切1\/5~1\/3放入丛生芽点诱导培养基上，培养2周后，外植体形成了芽点；c将形成芽点的外植体，转移到植株再生培养基上进行培养，长成再生植株；（4）砧木的准备：a以珍珠岩作为砧木种子催芽的无菌培养基质，加入MS液体培养基后高压灭菌；b将花生种子消毒，用无菌水清洗后，接种于培养基，催芽6~8日得到花生种子实生苗；（5）再生苗无菌嫁接及移栽：a以再生植株作为接穗，花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接；b将嫁接苗再返回盛有珍珠岩的培养基中，培养3-5天，使伤口愈合；c炼苗1~2天后，移栽塑料大棚、温室或田间。
设计方案
1.一种花生植株再生方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）制备丛生芽点诱导培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加0.1～ 0.2mg\/L 的TDZ和1～3mg\/L 的2,4-D制成丛生芽点诱导培养基；
制备植株再生培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加0.01～0.05mg\/ L 的TDZ制成植株再生培养基；
（2）选择外植体材料：花生种子去种胚后的子叶节为外植体材料；
（3）丛生芽点诱导及植株再生：
a将花生种子进行消毒，用无菌水清洗后，将种子浸泡在无菌水中；
b从无菌水中取出种子剥去种皮，去除种胚，从子叶上靠近子叶节的位置横切1\/5~1\/3 放入丛生芽点诱导培养基上，培养2周后，外植体形成了芽点；
c将形成芽点的外植体，转移到植株再生培养基上进行培养，长成再生植株；
（4）砧木的准备：
a以珍珠岩作为砧木种子催芽的无菌培养基质，加入MS液体培养基后高压灭菌；
b将花生种子消毒，用无菌水清洗后，接种于培养基，催芽6~8日得到花生种子实生苗；
（5）再生苗无菌嫁接及移栽：
a以再生植株作为接穗，花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接；
b将嫁接苗再返回盛有珍珠岩的培养基中，培养3-5天，使伤口愈合；
c炼苗1~2天后，移栽塑料大棚、温室或田间。
2.根据权利要求1所述的花生植株再生方法，其特征在于：所述步骤（3）中花生种子消 毒采用的是75%的乙醇浸泡50~70s，再用0.1%升汞中浸泡14-16 min或用0.2%次氯酸钠溶液 中浸泡11~12min。
3.根据权利要求1所述的花生植株再生方法，其特征在于：所述步骤（3）中在温度为24~ 26℃、光照强度为1500~2500Lx、光照时间为每日光照13小时的培养条件下培养。
4.根据权利要求3所述的花生植株再生方法，其特征在于：光照时间为从早晨6点至晚 上7点。
5.根据权利要求1所述的花生植株再生方法，其特征在于：所述步骤（4）中消毒后的种 子接种于灭菌的盛有珍珠岩的培养瓶中，播种深度2cm，在温度26±1℃，光照强度2000Lx， 每日早晨6点至晚上7点光照13小时的条件下催芽。
6.根据权利要求1所述的花生植株再生方法，其特征在于：所述步骤（5）中培养瓶开瓶 口炼苗1天后，移栽塑料大棚或温室或田间，移栽初期10天用地膜覆盖保持水分，上午10点 至下午4点加盖遮阴网。
设计说明书
技术领域
本发明属于花生组织培育领域，具体涉及一种花生植株再生方法。
背景技术
花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要 地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产 量和质量，尽管育种家们试图培育抗逆品种，但由于花生栽培种中缺乏高抗性品种资源，抗 病品种的选育一直是个难以解决的问题。目前，抗性基因的遗传转化及离体诱变育种受到 国内外广泛重视。而能否将基因转化和离体诱变成功应用于花生育种，关键依赖于花生组 织培养高效植株再生体系的建立。
近年来，国内外研究者开展了利用花生不同外植体离体培养再生植株的研究，但 一般植株再生频率比较低，并且植株再生慢。如国家授权发明专利“一种花生体胚诱导及植 株再生的方法”，利用种子胚小叶作为外植体，在体胚诱导培养基上培养30天后，转移到体 胚萌发培养基上培养，每隔25～30d继代一次，继代两次得到再生苗，也即从接种至得到再 生苗需要将近4个月的时间，耗费培养室空间和电能，转接培养基操作次数多，耗费大量人 力物力财力。
发明内容
本发明的目的是提供一种花生植株再生方法，使用本发明的技术方案可以显著缩 短获得再生苗的时间。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案来实现：
本发明提供了一种花生植株再生方法，所述方法包括以下步骤：
(1)制备丛生芽点诱导培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加 TDZ和2，4-D制成丛生芽点诱导培养基；
制备植株再生培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ制成植 株再生培养基；
(2)选择外植体材料：花生种子去种胚后的子叶节为外植体材料；
(3)丛生芽点诱导及植株再生：
a将花生种子进行消毒，用无菌水清洗后，将种子浸泡在无菌水中；
b从无菌水中取出种子剥去种皮，去除种胚，从子叶上靠近子叶节的位置横切1\/5 ～1\/3放入丛生芽点诱导培养基上，培养2周后，外植体形成了芽点；
c将形成芽点的外植体，转移到植株再生培养基上进行培养，长成再生植株；
(4)砧木的准备：
a以珍珠岩作为砧木种子催芽的无菌培养基质，加入MS液体培养基后高压灭菌；
b将花生种子消毒，用无菌水清洗后，接种于培养基，催芽6～8日得到花生种子实 生苗；
(5)再生苗无菌嫁接及移栽：
a以再生植株作为接穗，花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接；
b将嫁接苗再返回盛有珍珠岩的培养基中，培养3-5天，使伤口愈合；
c炼苗1～2天后，移栽塑料大棚、温室或田间。
进一步的：所述步骤(1)中丛生芽点诱导培养基中TDZ的添加量为0.1～0.2mg\/L， 2，4-D的添加量为1～3mg\/L。
进一步的：所述步骤(1)中植株再生培养基中TDZ的添加量为0.01～0.05mg\/L。
进一步的：所述步骤(3)中花生种子消毒采用的是75％的乙醇浸泡50～70s，再用 0.1％升汞中浸泡14-16min或用0.2％次氯酸钠溶液中浸泡11～12min。
进一步的：所述步骤(3)中在温度为24～26℃、光照强度为1500～2500Lx、光照时 间为每日光照13小时的培养条件下培养。
进一步的：光照时间为从早晨6点至晚上7点。
进一步的：所述步骤(4)中消毒后的种子接种于灭菌的盛有珍珠岩的培养瓶中，播 种深度2cm，在温度26±1℃，光照强度2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时的条件下 催芽。
进一步的：所述步骤(5)中培养瓶开瓶口炼苗1天后，移栽塑料大棚或温室或田间， 移栽初期10天用地膜覆盖保持水分，上午10点至下午4点加盖遮阴网。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
1、本发明以花生子叶节作为外植体，在基本培养基中添加0.1～0.2mg\/L TDZ(噻 苯隆，又名苯基噻二唑基脲))和1～3mg\/L 2，4-D(氯化苯氧乙酸)所形成的丛生芽点诱导培 养基上及在基本培养基中添加0.01～0.05mg\/L TDZ所形成的植株再生培养基上，进行丛生 芽点诱导及其植株再生，经试验表明，丛生芽点诱导率95％以上，植株再生频率达到100％， 每个外植体再生植株数20个以上。
2、本发明以花生子叶节作为外植体，子叶节部位内原激素水平较高，分化能力较 强，不但植株再生频率高，每个外植体再生植株数多，并且植株再生快，在丛生芽点诱导培 养基上培养2周后，转移到植株再生培养基上再培养4周即可得到再生苗，比专利“一种花生 体胚诱导及植株再生的方法”中获得再生苗的时间缩短2个半月，具有明显的技术效果；并 且培养材料只需转接一次即可，从而节省大量人力物力财力。、
附图说明
图1为花生苗，其中，箭头所指为子叶节；
图2为花生种子、子叶、子叶节、种胚；
图3为接种的子叶节外植体；
图4为子叶节外植体在丛生芽点形成培养基上培养2周后形成的丛生芽点；
图5为在植株再生培养基上培养4周后，丛生芽点发育长成的植株；
图6为在珍珠岩中无菌催芽2天后发芽的花生种子；
图7为珍珠岩中无菌催芽的花生实生苗；
图8为珍珠岩中无菌催芽7日龄的花生苗；
图9为再生苗作为接穗的嫁接苗；
图10为嫁接苗再栽植于珍珠岩中；
图11为移栽塑料大棚正常生长的嫁接苗；
图12为嫁接苗结果，箭头指嫁接口。
具体实施方式
TDZ(噻苯隆，又名苯基噻二唑基脲)是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞 分裂素活性，并且具有细胞分裂素和生长素的双重作用，可以促进植物芽的再生和繁殖，打 破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等。2，4-D(二氯苯氧乙酸)是 一种除草剂，也是一种人工合成的植物生长素，可用于诱导细胞分裂、愈伤组织的形成。以 往在组织培养中大多选用生长素类2，4-D、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)和细胞分裂素类6- BA(6-苄氨基嘌呤)、KT(激动素)、ZT(玉米素)等作为脱分化和再分化的调节物质，而对TDZ 研究较少。
农学通报2015,31(21)，149-156报道的“花生胚轴的离体诱导与植株再生”，利用 上胚轴和下胚轴作为外植体，在MS+TDZ 1mg\/L+6-BA 1mg\/L+NAA 0.5mg\/L+AgNO3 3mg\/L丛 生芽诱导培养基上培养，上胚轴外植体丛生芽分化率只有1个品种达到70％，其他3个品种 均在50％以下，平均每个外植体再生不定芽仅有4.5个；而利用下胚轴作为外植体，4个品种 的丛生芽分化率仅为31.7％～41.8％。
因为TDZ的细胞分裂素活性强，本发明对TDZ的适宜浓度进行了研究，结果是低浓 度的TDZ(0.01～0.2mg\/L)有利于丛生芽形成和植株再生。
实施例1
1、制备丛生芽点诱导培养基：
选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ和2，4-D制成丛生芽点诱导培 养基，TDZ的添加量为所述基本培养基中添加0.1～0.2mg\/L，2，4-D的添加量为所述基本培 养基中添加1～3mg\/L，本实施例中丛生芽点诱导培养基为MS+0.1mg\/L TDZ+2mg\/L 2，4-D+ 0.8％琼脂+3％蔗糖，pH调至5.8。
2、制备植株再生培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ制成 植株再生培养基，TDZ的添加量为所述基本培养基中添加0.01～0.05mg\/L，本实施例中植株 再生培养基为MS+0.01mg\/L TDZ+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH调至5.8。TDZ的作用：在此步骤中 诱导丛生芽点发育成不定芽。
3、选择外植体材料：
供试材料为目前广泛推广栽培的花生品种鲁花11号、花育20号、花育22号、花育25 号，选取各品种成熟饱满的种子去种胚后的子叶节作为试验材料。
花生子叶节就是子叶节与主茎交接的部位，见图1。因种子尚未分化主茎，种子中 子叶节与胚芽交接的部位即为子叶节，见图2。因为花生子叶节位置是花生第一队侧枝分化 的位置，内原激素含量高，从而启动侧枝分化的基因表达，长出侧枝。本发明对生长于田间 的花生侧枝的分化进行过研究，将长出的侧枝摘掉，不久又会长出侧枝，再摘再长。说明子 叶节部位是一个特殊的部位，分化能力极强。因此，本发明选择子叶节作为外植体，利用子 叶节节部位内原激素含量高、分化能力强的特点，并结合培养基中添加适宜的激素种类和 浓度，提高植株再生效率。
4、丛生芽点诱导及植株再生：
(1)选取饱满花生种子首先在75％乙醇中浸泡1min，然后在0.1％升汞中浸泡 15min或0.2％次氯酸钠溶液中浸泡11分钟，最后用灭菌的蒸馏水洗涤4～5次除去残留的消 毒剂，将种子在灭菌的蒸馏水中浸泡2～4小时。
(2)从灭菌的蒸馏水中取出种子剥去种皮，去除种胚，靠近子叶节的位置从子叶上 横切1\/5～1\/3(根据种子大小)，放入丛生芽点诱导培养基上培养，见图3。培养条件为：培养 室温度26±1℃，光照强度2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时。
在丛生芽点诱导培养基上培养2周后，子叶节外植体形成了绿色丛生芽点，见图4。 统计丛生芽点形成率于表1，供试的4各品种，绿色芽点形成率均在90％以上。
表1在添加0.1mg\/LTDZ和2mg\/L2，4-D的培养基上培养2周后，子叶节外植体形成丛 生芽点的频率
申请码:申请号:CN201811653598.9 申请日:2018-12-29 公开号:CN109479721A 公开日:2019-03-19 国家:CN 国家/省市:95(青岛) 授权编号:CN109479721B 授权时间:20190607 主分类号:A01H4/00 专利分类号:A01H4/00 范畴分类:12A;18H; 申请人:青岛农业大学 第一申请人:青岛农业大学 申请人地址:266000 山东省青岛市城阳区长城路700号 发明人:禹山林;王晶珊;乔利仙;隋炯明;杨庆利;徐坤;蒋学杰;赵健;史普祥;张瑞清;张力凡 第一发明人:禹山林 当前权利人:青岛农业大学 代理人:王晓晓 代理机构:37264 代理机构编号:青岛合创知识产权代理事务所(普通合伙) 优先权:关键词:当前状态:审核中 类型名称:外观设计
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