嗜酸性喜温硫杆菌中硫代硫酸盐代谢途径调控机制研究

论文摘要

嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus,简称A.caldus）是一种化能自养细菌,该细菌中度嗜酸嗜热,能够氧化元素硫和各种还原性的无机硫化合物,并从中获得能量和还原力,以此来完成自身的生长代谢。A.caldus是生物冶金的优势菌株,被广泛应用于生物浸出和生物脱硫。A.caldus体内存在一套复杂而又高效的无机硫化合物的代谢系统。其中,硫代硫酸盐是在整个硫代谢系统中非常重要的中间代谢产物,它能够通过连四硫酸盐介导的硫代硫酸盐代谢途径（S4I pathway）以及Sox系统进行代谢。因此,本文旨在揭示S4I途径的作用和调控机制,深入了解A.caldus整个硫代谢系统,以及相关的调控机制。本论文的研究工作主要从以下四个方面展开:第一,利用生物信息学手段对S4I途径中的反应调控蛋白RsrR进行分析:根据RsrR蛋白的氨基酸序列,利用在线分析软件对RsrR蛋白的理化性质、二级结构以及三级结构进行了预测和分析,结果表明RsrR为胞内亲水性稳定蛋白,无跨膜螺旋和信号肽。此外,根据RsrR蛋白的氨基酸序列,利用在线软件,对RsrR蛋白的的保守性氨基酸位点进行了分析,同时还对RsrR蛋白及其同源性较高的OmpR蛋白进行了序列比对分析,为进一步探究RsrR蛋白的结构及功能提供了理论依据。第二,以绿色荧光蛋白的编码基因（egfp）为报告基因验证RsrS-RsrR双组分调控系统:通过构建报告基因的质粒,并将质粒分别接合转移至A.caldus野生株、△rsrR、△rsrS三种菌株中,使用0.8%硫粉为能源培养4d后以及4d后加入3g/L连四硫酸盐刺激0.5d收集的菌体提取RNA并进行RT-qPCR验证该双组分调控系统,结果表明该双组分调控系统确实能够调控tetH基因簇下游tetH和tqo基因的转录。第三,预测了反应调控蛋白RsrR的关键氨基酸位点并进行实验验证:通过查阅文献,序列比对及结构模拟等生物信息学方法共预测出11个可能的关键氨基酸位点。并将其分为两类:第一类是直接影响RsrR蛋白与tetH启动子上IRS序列的结合;第二类是间接影响RNA聚合酶的活性。因此,对包括RsrR及其氨基酸位点突变的共12个蛋白进行了表达纯化,然后进行初步的体外凝胶迁移阻滞实验（EMSA）验证,以及进一步的体内RT-qPCR的转录分析验证。实验结果证明了共有7个氨基酸属于关键氨基酸,其中6个氨基酸突变能直接影响RsrR蛋白与IRS序列的结合,1个氨基酸突变可以间接影响RNA聚合酶的活性。第四,预测了 RsrR蛋白结合的tetH启动子序列的关键碱基位点并进行实验验证:通过查阅文献以及DNase I足迹实验,确定了在两个定向重复序列中3个可能的关键碱基,然后通过体外EMSA实验分别进行了单侧单点碱基突变和双侧双点重复碱基突变来进行关键碱基位点的验证。实验结果表明,这3个碱基确实是RsrR蛋白与tetH启动子序列结合的关键碱基。本次研究首次对S4I途径中的RsrS-RsrR双组分调控系统中的反应调控蛋白RsrR以及其所结合的IRS调控序列,进行了比较深入全面的研究和分析,该研究进一步解释和完善了 S4I途径的调控机制,详细解释了 S4I途径的详细分子机制,基于该分子机制可以开发高效的合成生物学调控元件,具有重要的应用价值;同时,该研究对深入的了解整个硫代谢系统提供了理论依据,具有重要的科学意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景
•   1.1 嗜酸性喜温硫杆菌简介
•   1.2 嗜酸性喜温硫杆菌硫氧化系统的研究进展
•   1.3 嗜酸性喜温硫杆菌中硫代硫酸盐的氧化
• 4I途径'>    1.3.1 S₄I途径
•     1.3.2 Sox系统
•   1.4 双组分调控系统
•     1.4.1 双组分调控系统的基本组成和作用机制
•     1.4.2 双组分调控系统中HK的结构和活性
•     1.4.3 双组分调控系统中RR的结构和活性
•     1.4.4 嗜酸性喜温硫杆菌中的双组分调控系统
•   1.5 本论文研究意义和内容
•     1.5.1 研究意义
•     1.5.2 研究内容
• 第二章 嗜酸性喜温硫杆菌中RsrR蛋白的生物信息学分析
•   2.1 引言
•   2.2 材料和方法
•     2.2.1 软件与在线工具
•   2.3 研究结果
•     2.3.1 RsrR氨基酸序列的理化性质分析
•     2.3.2 RsrR蛋白二级结构预测与分析
•     2.3.3 RsrR蛋白三级结构预测与分析
•     2.3.4 RsrR蛋白保守性氨基酸残基分析
•     2.3.5 RsrR蛋白与OmpR蛋白氨基酸序列比对
• 第三章 RsrS-RsrR双组分系统调控方式研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 菌株与质粒
•     3.2.2 培养基和培养条件
•     3.2.3 试剂和仪器
•     3.2.4 实验操作技术
•   3.3 研究结果
•     3.3.1 egfp验证RsrS-RsrR双组分系统菌株构建
•     3.3.2 RNA质量及完整性的检测
•     3.3.3 cDNA的合成
•     3.3.4 荧光定量PCR验证结果
•   3.4 本章小结
• 第四章 RsrR蛋白关键氨基酸位点的研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料和方法
•     4.2.1 菌株和质粒
•     4.2.2 培养基和培养条件
•     4.2.3 试剂和仪器
•     4.2.4 分子生物学相关操作技术
•   4.3 实验结果与讨论
•     4.3.1 RsrR蛋白HTH结构域关键氨基酸位点的分析
•     4.3.2 RsrR及其氨基酸位点突变蛋白表达质粒的构建
•     4.3.3 RsrR及其氨基酸位点突变蛋白的异源表达
•     4.3.4 RsrR及其氨基酸位点突变蛋白的纯化
•     4.3.5 目的片段的扩增
•     4.3.6 RsrR及其氨基酸位点突变蛋白与T360片段的结合实验（EMSA）
•     4.3.7 RsrR及其氨基酸位点突变蛋白体内验证质粒的构建
•     4.3.8 RsrR及其氨基酸位点突变蛋白体内验证菌株的构建
•     4.3.9 RNA质量检测
•     4.3.10 荧光定量PCR验证结果
•     4.3.11 RsrR关键氨基酸位点的生物信息学分析
•   4.4 本章小结
• 第五章 tetH关键碱基位点的研究
•   5.1 引言
•   5.2 材料和方法
•     5.2.1 菌株和质粒
•     5.2.2 培养基和培养条件
•     5.2.3 试剂和仪器
•     5.2.4 分子生物学相关操作技术
•   5.3 实验结果与讨论
•     5.3.1 生物信息学分析
•     5.3.2 IRS关键碱基位点突变——单点突变
•     5.3.3 IRS关键碱基位点突变——双点突变
•   5.4 本章小结
• 第六章 全文总结与展望
•   6.1 本论文的主要创新点
•   6.2 本论文的不足之处及展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李亚轻

导师: 林建群

关键词: 嗜酸性喜温硫杆菌,途径,转录调控

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山东大学

分类号: Q933

总页数: 104

文件大小: 7504K

下载量: 97