高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及初步应用

论文摘要

根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构蛋白(NSP2)基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成NSP2特异性的引物和TaqMan探针,建立了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR, ddPCR)检测方法。结果显示,ddPCR最佳反应的引物和探针浓度分别为900 nM和250 nM;特异性和重复性检测结果表明,ddPCR具有良好的特异性和较高的重复性;灵敏度检测结果表明,ddPCR的检测灵敏度比荧光定量PCR高10倍;ddPCR的检测结果与标准品拷贝数的相关系数为R~2=0.999 1,表明该方法检测结果具有良好的线性关系和可信度;用建立好的ddPCR方法对10份临床样品的高致病性PRRSV进行了拷贝数定量。

论文目录

• 1 材料
•   1.1 病毒
•   1.2 临床样本
•   1.3 仪器与试剂
• 2 方法
•   2.1 引物和探针
•   2.2 病毒DNA/RNA的提取
•   2.3 微滴式数字PCR
•     2.3.1 微滴生成
•     2.3.2 PCR扩增
•     2.3.3 微滴读取
•   2.4 微滴式数字PCR反应条件优化
•     2.4.1 退火温度的优化
•     2.4.2 引物和探针浓度的优化
•   2.5 微滴式数字PCR特异性、重复性和敏感性试验
•     2.5.1 特异性试验
•     2.5.2 重复性试验
•     2.5.3 灵敏性试验及与荧光定量PCR（qPCR）比对试验
•   2.6 临床样本的检测
• 3 结果
•   3.1 退火温度的优化
•   3.2 引物和探针浓度的优化
•   3.3 微滴式数字PCR特异性和重复性试验
•   3.4 微滴式数字PCR灵敏性试验
•   3.5 微滴式数字PCR对临床样本中拷贝数的定量检测应用
• 4 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王林,孙丹,韦海涛,宋彦军,周德刚,高晓龙,梅力,冯小宇

关键词: 微滴式数字,绝对定量

来源: 中国兽医杂志 2019年12期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 北京市动物疫病预防控制中心

基金: 北京市农业局农业科技项目(20160127),北京市科技重大专项课题(Z171100001317013)

分类号: S852.651

页码: 27-30

总页数: 4

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