健康人群肠道中低丰度拟杆菌的筛选及生理作用研究

论文摘要

拟杆菌是肠道菌群的核心成员之一,含有大量编码碳水化合物活性酶的基因,且能够根据需要进行稳定的转换,降解或发酵人消化道难以消化的膳食纤维,产生大量的如乙酸、丙酸等短链脂肪酸及葡聚糖等代谢产物,从而帮助宿主分解多糖提高营养利用率、加快肠粘膜的血管形成以及免疫系统发育以提高宿主的免疫力并维持肠道微生态平衡。拟杆菌群之间既交互共生也相互拮抗,在人体肠道内表现较厚壁菌稳定。且不同的菌株能促进或抑制宿主的炎症反应。然而,受限于拟杆菌的普通分离手段,研究目标多为肠道内丰度较高的拟杆菌。因此,本文拟在现有研究基础上进一步完善肠道拟杆菌的分离方法,特别是建立针对低丰度拟杆菌的选择性筛选;以拟杆菌生理作用研究模式菌种脆弱拟杆菌为对照,研究低丰度拟杆菌对肠道菌群的调节模式;并通过体外和体内模型研究低丰度拟杆菌对肠道免疫的调节作用;并在此基础上探索具有益生功能的低丰度拟杆菌的安全性,为其后续的应用打下基础。具体研究结果如下:首先,根据拟杆菌对不同碳源的利用特性,优化现有拟杆菌筛选培养基,建立了两种针对肠道内低丰度拟杆菌的有效分离手段。其一是以木聚糖、鼠李糖或甘露醇为唯一碳源的培养基进行拟杆菌筛选,实验证明,以上三种碳源均能够提高低丰度的卵形拟杆菌（B.ovatus）的分离效率,并且,以木聚糖为唯一碳源的培养基还能够提高Prevotella corpi的分离效率,同时分离到了普通拟杆菌筛选方法未分离到的B.xylanisolvens。其二是青霉素浓缩法,将菌群样品经添加了青霉素并以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基富集4h后,再进行拟杆菌分离,能针对性地提高不能利用阿拉伯糖的低丰度B.cellulosilyticus及脆弱拟杆菌（B.fragilis）的分离效率。其次,采用正常小鼠及炎症小鼠模型,研究低丰度的卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对肠道菌群的调节作用。实验发现,低丰度拟杆菌对正常小鼠肠道菌群调节作用不明显,特别是卵形拟杆菌ELH-B2对菌群组成及SCFA分泌的调节作用还要弱于脆弱拟杆菌HCK-B3。同时,卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌均能缓和因LPS引起的菌群紊乱,特别是降低了与肿瘤形成相关的部分菌种,但脆弱拟杆菌降低了肠道中极少数短链脂肪酸的生成。再次,通过报告基因表达细胞株模型、健康小鼠及炎症小鼠模型研究低丰度的卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对宿主免疫的调节作用。在细胞模型中,所有的拟杆菌株均能激活Thp1-XBlue中NF-κB信号通路,并且不同拟杆菌对Thp1-XBlue细胞中NF-κB信号通路的激活水平存在种间差异。卵形拟杆菌针对NF-κB信号通路的激活及调节水平相对偏低,而脆弱拟杆菌则对LPS激活的NF-κB信号通路表现出明显的上调作用。在健康小鼠模型中,卵形拟杆菌ELH-B2对小鼠体内细胞因子、脾脏Treg细胞、NF-κB信号通路的激活水平等指标均无明显影响,脆弱拟杆菌HCK-B3虽明显激活了结肠组织中NF-κB信号通路,并且提高了结肠组织的通透性,但对结肠的组织结构无影响。已有研究报道,拟杆菌能够缓解由致病菌定植或恶唑酮等药物使用而引起的炎症,针对因肠道菌群紊乱或过量抗生素使用导致释放出大量LPS引起的感染尚未有研究报道。因此,本文建立LPS感染的小鼠炎症模型,实验发现,ELH-B2能够增加Treg细胞数量,从而帮助LPS炎症小鼠重新建立Treg/Th-17平衡。脆弱拟杆菌HCK-B3还能够降低促炎因子TNF-α、提高抑炎因子IL-10,进而缓解LPS炎症引起的炎症。脆弱拟杆菌虽显著上调了LPS炎症小鼠体内NF-κB信号通路及结肠组织通透性,然而未影响结肠组织的完整性。依据已有研究判断,这类轻微地破坏作用实则为其通过腹膜发挥进一步的抑炎作用打下基础。综合上述低丰度拟杆菌对肠道菌群及宿主免疫调节作用的研究成果,卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3也具有新一代益生菌的潜质。因此,对其在体内的安全性进行了深入的评价,为后续的商业及临床应用打下基础。实验发现,卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3均无鞭毛,无运动性。HCK-B3无溶血性,但ELH-B2轻微溶血。经过全基因组序列比对,未发现与ELH-B2及HCK-B3完全相同的已知菌株。ELH-B2及HCK-B3基因组中不存在明确致病的毒力基因及基因岛,并且与脆弱拟杆菌ATCC25285相似,HCK-B3存在合成多糖A（PSA）的重要基因。ELH-B2及HCK-B3均能耐受氨苄青霉素、头孢曲松钠、克林霉素、卡那霉素、红霉素及多粘菌素,ELH-B2还能耐受环丙沙星及万古霉素,然而,ELH-B2及HCK-B3的基因组中均不含质粒与抗生素耐受因子转运相关的基因岛,因此其抗生素的耐受特性转移至其他肠道菌的可能性较小。通过急性小鼠实验发现,每日109cfu剂量的卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3对健康小鼠无毒副作用。为进一步验证这两株拟杆菌的安全性,采用了环磷酰胺造模的免疫低下小鼠,环磷酰胺对小鼠免疫系统的抑制表现为体重下降、免疫细胞、血小板及血红蛋白的减少及脾脏组织结构的严重破坏。但每日109cfu剂量的卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3对免疫低下小鼠体重、血常规、肝功能、细胞因子分泌及肝脏、脾脏、结肠的组织结构均无影响,而且能够部分恢复异常的肝功能指标,HCK-B3还提高了免疫抑制小鼠体内抑炎因子的浓度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写符号
• 第一章 绪论
•   1.1 肠道菌群
•     1.1.1 肠道菌群的组成
•     1.1.2 肠道菌群组成的影响因素
•   1.2 人体肠道中的拟杆菌
•     1.2.1 拟杆菌的种类
•     1.2.2 拟杆菌的丰度
•     1.2.3 拟杆菌的生理作用
•   1.3 肠道中低丰度拟杆菌的研究进展
•     1.3.1 低丰度拟杆菌的分离方法
•     1.3.2 低丰度拟杆菌生理作用的研究进展
•   1.4 论文立题背景及意义
•   1.5 论文的主要研究内容
• 第二章 健康人群肠道中低丰度拟杆菌筛选方法的优化建立
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料与设备
•     2.2.1 试剂
•     2.2.2 主要仪器与设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 粪便样品的采集与处理
•     2.3.2 拟杆菌的常规分离方法
•     2.3.3 低丰度拟杆菌的特异性筛选方法
•     2.3.4 细菌16srDNA鉴定
•     2.3.5 拟杆菌生长曲线的测定
•     2.3.6 数据统计与分析
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 常规方法分离健康人群肠道中拟杆菌种的分布情况
•     2.4.2 低丰度拟杆菌特异性分离方法的优化设计
•     2.4.3 低丰度拟杆菌特异性分离方法的效率分析
•     2.4.4 低丰度拟杆菌特异性分离方法的验证
•   2.5 本章小结
• 第三章 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对肠道菌群的的调节作用解析
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料与设备
•     3.2.1 试剂
•     3.2.2 实验菌株及培养基
•     3.2.3 实验动物
•     3.2.4 主要仪器与设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 拟杆菌的培养及拟杆菌剂的制备
•     3.3.2 动物实验设计
•     3.3.3 菌群组成的测定
•     3.3.4 粪便样品中短链脂肪酸含量的测定
•     3.3.5 数据统计与分析
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对正常小鼠肠道菌群组成的影响
•     3.4.2 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对正常小鼠肠道内SCFA产量的影响
•     3.4.3 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对LPS感染小鼠肠道菌群组成的影响
•     3.4.4 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对LPS感染小鼠肠道内SCFA产量的影响
•   3.5 本章小结
• 第四章 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对宿主免疫的调节作用解析
•   4.1 前言
•   4.2 实验材料与设备
•     4.2.1 试剂
•     4.2.2 菌株及细胞
•     4.2.3 培养基
•     4.2.4 实验动物
•     4.2.5 主要仪器与设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 单核细胞Thp1-XBlue的培养
•     4.3.2 细胞实验设计
•     4.3.3 拟杆菌的培养与灌胃拟杆菌剂的制备
•     4.3.4 动物实验设计
•     4.3.5 小鼠血液及结肠组织中免疫因子的测定
•     4.3.6 小鼠脾脏组织中Treg细胞的水平测定
•     4.3.7 小鼠结肠组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达水平的测定
•     4.3.8 小鼠肠道通透性的测定
•     4.3.9 小鼠结肠组织切片病理观察
•     4.3.10 数据统计与分析
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 拟杆菌对Thp1-Xblue细胞中NF-κB信号通路激活水平的影响
•     4.4.2 拟杆菌对LPS刺激后的Thp1-XBlue细胞中NF-κB信号通路的调节作用
•     4.4.3 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对正常小鼠及LPS感染小鼠体内免疫因子分泌水平的影响
•     4.4.4 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对正常小鼠及LPS感染小鼠体内适应型免疫指标的调节作用
•     4.4.5 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对正常小鼠及LPS感染小鼠体内结肠组织中NF-κB信号通路激活水平的影响
•     4.4.6 卵形拟杆菌及脆弱拟杆菌对正常小鼠及LPS感染小鼠体内肠道通透性及结肠组织完整性的影响
•   4.5 本章小结
• 第五章 卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3的安全性评价
•   5.1 前言
•   5.2 实验材料与设备
•     5.2.1 试剂
•     5.2.2 菌株及培养基
•     5.2.3 实验动物
•     5.2.4 主要仪器与设备
•   5.3 实验方法
•     5.3.1 拟杆菌的培养与灌胃拟杆菌剂的制备
•     5.3.2 拟杆菌溶血性及运动型的测定
•     5.3.3 拟杆菌全基因组测序
•     5.3.4 拟杆菌潜在毒力基因及抗生素耐受基因的鉴定
•     5.3.5 抗生素对拟杆菌最低抑制浓度（MIC）的测定
•     5.3.6 动物实验设计
•     5.3.7 小鼠血常规及肝功能相关指标的测定
•     5.3.8 小鼠血液中细胞因子的测定
•     5.3.9 小鼠组织切片病理观察
•     5.3.10 数据统计与分析
•   5.4 结果与讨论
•     5.4.1 卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3的形态学特征
•     5.4.2 卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3的亲缘特性
•     5.4.3 卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3的潜在毒力基因
•     5.4.4 卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3的抗生素耐受性
•     5.4.5 卵形拟杆菌ELH-B2及脆弱拟杆菌HCK-B3的体内安全性评价
•   5.5 本章小结
• 主要结论与展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录Ⅰ：作者在攻读博士学位期间取得的成果
• 附录Ⅱ
• 附录Ⅲ

文章来源

类型: 博士论文

作者: 谭惠子

导师: 陈卫

关键词: 卵形拟杆菌,脆弱拟杆菌,肠道菌群,免疫应激,安全性评价

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

分类号: TS201.3

总页数: 100

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