1.上海海洋大学上海201306；2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所杭州3100212
摘要：目的本文研究乙酯型蚕蛹油制剂对哺乳动物的遗传毒性和急性毒性的影响，了解乙酯型蚕蛹油制剂可能存在的远期危害和毒性作用。方法采用遗传毒性试验和大鼠急性毒性试验，采用Ames试验、观察10.00g/kg·BW、5.00g/kg·BW和2.50g/kg·BW剂量的乙酯型蚕蛹油制剂对小鼠骨髓细胞微核率的影响、小鼠精子畸形试验及对大鼠产生急性毒性作用。结果三项遗传性试验结果均阴性，通过大鼠急性毒性试验也未观察到与受试物有关的毒性作用的最大剂量。结论实验未观察到乙酯型蚕蛹油制剂对哺乳动物产生遗传毒性和急性毒性作用，也未发现其可能存在的远期危害，有关其在其它方面的毒理学作用将是今后进一步研究的目标。
关键词：乙酯型蚕蛹油；遗传毒性；急性毒性
Abstract［Objective］Toexploretheeffextsofethylsilkwormoilagentongenetictoxicityandsubacutetoxicityinmammals.［Methods］Myoloidcellmicroneucleontestinmouseandsubacutetoxicitytestinratswerecarriedoutandtheefffectofethylsilkwormoilandatdosesof10.00g/kg·BW、5.00g/kg·BWand2.50g/kg·BWonthemicronuleiofmiceandthesubacutetoxicityofratswereobserved.［Results］Itwasobservedthatethylsilkwormoilagentsshowedsignificantinductionofformationofmicronucleiinthemiceandtherenomaximumsubacutetoxicitydoseofethylsilkwormoilagentinratswasobserved.[Conclusion］Therenogenetictoxicityandsubacutetoxicityofethylsilkwormoilagentonmammalsisobservednorforwardharmfulnessisfoundeither.
KeywordsEthylsilkwormoil，Genetictoxicity，Subacutetoxicity
蚕蛹为蚕蛾科昆虫家蚕蛾的蛹，既是一种高营养的美食，也是一味中药，具有和脾胃、祛风湿、长阳气之功效[1]，自古以来就得到广泛应用。我国卫生部已将蚕蛹列为既是食品义是药品的食品新资源，其功效在《本草纲目》及《中华药典》中均有记载。干蚕蛹的主要成分为蛋白质和蚕蛹油[2]。蚕蛹油中主要成分是不饱和脂肪酸[3]，包括油酸、亚油酸、亚麻油酸等，其中α-亚麻酸含量达30%左右[4]。α-亚麻酸和亚油酸对治疗高血压、高血脂、血管硬化、高胆固醇等均有较好的药效[5]。为提高蚕蛹油的保健功能，必须提高α-亚麻酸及亚油酸等有效成份的含量，用普通方法不仅难以对有效成分进行浓缩，而且分离浓缩时间长、成本高、操作复杂、产品易发生异构化[6]。
我国很多地方有吃蚕蛹的习惯，然而缫丝后的蚕蛹会产生变质和腐败[7]，未经处理直接食用存在很大的安全风险。近年来，以蚕蛹为原料的新食品被不断开发出来，乙酯型蚕蛹油[8]就是其中之一。本研究拟通过观察乙酯型蚕蛹油制剂对哺乳动物的遗传毒性和急性毒性[9-10]的影响，了解乙酯型蚕蛹油制剂可能存在的远期危害和遗传毒性[11]作用。
1材料与方法
1.1实验动物SPF级昆明小鼠，体重25～30g；SD种大鼠，体重70～90g。
1.2主要试剂与仪器乙酯型蚕蛹油软胶囊，南通福尔生物制品有限公司提供，环磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）；雅培CD3700全自动血球计数仪，OLYMPUSAU400全自动生化分析仪。
1.3试验菌株
鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102试验菌株。
1.4方法
1.4.1急性毒性实验
1.4.1.1小鼠急性毒性实验
采用最大耐受剂量法。选用体重为18-22g的SPF级昆明种小鼠20只，雌雄各半，取乙酯型蚕蛹油软胶囊软胶囊内容物经口给小鼠灌胃1次，灌胃体积为0.2ml/10g·bw，测定受试物比重为0.878g/ml，折合剂量为17.56g/kg·bw。灌胃前禁食16小时，灌胃后连续观察两周，记录中毒表现及死亡情况。
1.4.2遗传毒性实验
1.4.2.1Ames实验
采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA1024株试验菌株进行试验。采用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝微粒体酶（S-9）作为体外活化系统。试验设五个剂量分别为5000μg/皿、1000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿、8μg/皿，同时设自动回变、溶剂对照和阳性突变剂对照。样品配制时，无菌条件下称取样品内容物1.25g加DMSO至25ml，为5000μg/皿剂量，取此液5ml加溶剂至25ml配成1000μg/皿，以下三个剂量如此类推配制。试验时在顶层琼脂中加入0.1ml试验菌株增菌液、0.1ml受试物溶液和0.5mlS9混合液（当需要代谢活化时），混均后倒入底层培养基平板上，37℃培养48小时，计数每皿菌落数。如果受试物的回变菌落数超过自发回变菌落数的2倍以上，并有剂量—反应关系者定为阳性。整套试验在相同试验条件下重复做一次。
1.4.2.2小鼠骨髓细胞微核实验
采用间隔24小时两次经口灌胃法进行试验。取体重为25g~30g的昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。以40mg/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，食用植物油为阴性对照。乙酯型蚕蛹油样品实验组高、中、低3个剂量分别为10.00g/kg·bw、5.00g/kg·bw、2.50g/kg·bw，分别取样品50.00g、25.00g和12.50g加食用植物油至100ml，配成相应剂量的受试液给小鼠灌胃（0.2ml/10g·bw）。末次给样后6小时颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），微核发生率以含微核的PCE千分率计，计算200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞于成熟红细胞的比值（PCE/NCE），用Spss11.0软件进行统计分析。
1.4.2.3小鼠精子畸变实验
取体重25g~35g的雄性昆明种小鼠25只，随机分为5组，每组5只。以40mg/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，食用植物油为阴性对照。试验组高、中、低3个剂量分别为10.00g/kg·bw、5.00g/kg·bw、2.50g/kg·bw，分别取样品50.00g、25.00g和12.50g加食用植物油至100ml，配成相应剂量的受试液给小鼠灌胃（0.2ml/10g·bw）。每日灌胃一次，连续5天，于末次灌胃后的第30天处死动物，取双侧副睾，做精子涂片，伊红染色，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率。用Spss11.0软件进行统计分析。
1.4.3大鼠30d喂养试验
取SD大鼠80只，雌雄各半，将实验动物随机分为四组，即对照组及三个受试物组，每组20只，雌雄各半。设样品低、中、高剂量分别为1.25g/kg·bw、2.50g/kg·bw、5.00g/kg·bw（相当于人体推荐剂量的25、50、100倍）。采取将样品掺入饲料中给样，按体重的10%折算饲料的摄入量。低、中、高剂量分别按1.25%、2.50%、5.00%的比例将样品掺入基础饲料中，并保证各组饲料蛋白质含量均衡。对照组给予基础饲料，连续30天。
1.4.4实验方法
实验期间所有动物单笼饲养，自由摄食饮水，每天观察动物的活动和生长情况，每周加食2次，记录给食量和剩食量，每周称一次体重，计算食物摄入量和食物利用率。给受试物30天后禁食16小时采血，禁食前和禁食后称动物体重。采血时，每只大鼠摘眼球采集两份血：抗凝用雅培CD3700全自动血球计数仪测定血红蛋白（Hb）、红细胞积压（HCT）、进行红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血小板（PLT）计数及WBC分类。非抗凝血分享血清，用OLYMPUSAU400全自动生化分析仪测定TP、ALB、ALT、Cr、BUN、AST、CHOL、TG和GLU。采血后颈椎脱臼处死动物作大体解剖，称肝、肾、脾、睾丸重量，计算脏/体比值，取肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸、卵巢作病理切检查。在对各剂量组动物作大体检查未发现明显病变和生化指标改变时，只进行最高剂量组及对照组动物主要脏器的组织病理学检查，如发现病变则对较低剂量组相应器官及组织进行检查。
1.4.5实验数据统计
用Excel2003、Spss11.0软件进行统计分析。用Spss软件分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍为达到方差齐的目的，改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的Tamhane'sT2检验进行两两比较。
2结果
2.1大小鼠的急性经口毒性试验
由表1、2可见，以17.56g/kg·bw剂量的样品给两种性别的昆明种小鼠灌胃后未见明显中毒症状，观察14天无死亡。实验末将受试动物处死进行解剖检查，肝、脾、肾、胃、肠、心、肺等主要脏器，未见明显异常改变。样品对雌、雄昆明种小鼠的最大受剂量（MTD）大于17.56g/kg·bw。根据《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中的急性毒性分级标准，属无毒级。
2.2遗传毒性试验
2.2.1Ames试验
2.3.4受试物对大鼠脏器重量和脏器/体重比值的影响
各剂量组大鼠禁食后体重、肝、肾、脾、睾丸重量和肝/体、脾/体、肾/体、雄鼠睾/体比值与对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）。
3结论
在本研究条件下，乙酯型蚕蛹油对昆明种雌、雄小鼠的最大耐受剂量（MTD）均大于17.56g/kg·bw，属无毒级；三项遗传毒性试验（Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸变试验）结果均为阴性，未观察到乙酯型蚕蛹油制剂有明显遗传毒性作用。
参考文献：
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作者简介：赵清波（1987-），女，硕士研究生。研究方向：食用油脂质量与安全。
通讯作者：王伟，副研究员.