新型冠状病毒GDS04及HKU2的N蛋白抑制Ⅰ型干扰素通路研究

论文摘要

2017年,一种新型α冠状病毒在我国广东养殖场出现,该病毒感染猪并引起腹泻,导致很高的小猪死亡率。该新病毒被命名为GDS04（也称为SeACoV）,全基因组分析显示,猪冠状病毒GDS04和蝙蝠冠状病毒HKU2亲缘关系密切,可能由HKU2跨物种传播而来。冠状病毒核衣壳蛋白（Nucleocapsid,N）是高表达蛋白,已知多种冠状病毒的N蛋白有调节宿主免疫应答、增强病毒感染和致病的能力,同时N蛋白也是冠状病毒的重要检测靶点。为此,本研究的目的是制备GDS04病毒N蛋白抗体用于病毒诊断,同时研究N蛋白是否参与调控宿主干扰素产生。根据已发表的猪冠状病毒GDS04及蝙蝠冠状病毒HKU2基因组序列,构建GDS04和HKU2的N基因全长真核和原核重组蛋白表达载体。在293T细胞中表达GDS04和HKU2的N蛋白,利用双荧光素酶报告系统,探究GDS04和HKU2的N蛋白是否调节宿主先天免疫。利用qRT-PCR和双荧光素酶报告实验确认GDS04和HKU2的N蛋白是否抑制下游ISG表达。同时在大肠杆菌中利用IPTG诱导表达重组N蛋白,通过镍柱进行纯化,利用佐剂乳化重组蛋白免疫小鼠。研究结果证实,在293T、Hela、和A549细胞中GDS04和HKU2的N蛋白均能高水平表达而且表达的N蛋白能抑制I型干扰素表达,以及抑制下游的ISG54的生成,但是对NF-κB信号通路则没有影响。成功表达和纯化了N基因重组蛋白,并获得了小鼠多克隆抗体,抗N蛋白血清的效价很高,可以用于GDS04和HKU2的N蛋白的ELSIA和Wester-blot检测。本研究初步揭示了猪新型α冠状病毒GDS04及相关蝙蝠冠状病毒HKU2的N蛋白具有调节宿主免疫应答的功能,能显著抑制宿主I型干扰素通路。制备的高效价抗血清可用于N蛋白的Western-blot和ELISA检测。研究结果为后续的GDS04冠状病毒及相近病毒检测、致病和种间传播机制研究提供了参考借鉴。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 冠状病毒概述
•     1.1.1 冠状病毒分类
•     1.1.2 冠状病毒基因结构和复制
•   1.2 宿主先天免疫系统概述
•     1.2.1 Toll样受体及其信号转导
•     1.2.2 RIG-I样受体及其信号转导
•     1.2.3 NOD样受体及其信号转导
•   1.3 冠状病毒的N蛋白调节宿主先天免疫的研究进展
•   1.4 课题研究目的及方案
• 第2章 GDS04和HKU2的N蛋白抑制I型干扰素
•   2.1 前言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 实验试剂与耗材
•     2.2.2 仪器设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 SeV病毒增殖
•     2.3.2 血凝效价检测
•     2.3.3 RNA的提取
•     2.3.4 RNA逆转录
•     2.3.5 荧光定量PCR
•     2.3.6 蛋白质提取
•     2.3.7 蛋白质浓度测定
•     2.3.8 Western Blot实验
•     2.3.9 双荧光素酶报告基因
•     2.3.10 统计学分析
•   2.4 实验结果
•     2.4.1 GDS04和HKU2的N基因真核表达质粒的构建
•     2.4.2 GDS04和HKU2的N蛋白抑制干扰素的表达
•     2.4.3 GDS04和HKU2的N蛋白不影响NF-κB信号通路
•     2.4.4 GDS04和HKU2的N蛋白抑制干扰素刺激因子ISG54
•   2.5 小结与讨论
• 第3章 GDS04 N蛋白的多克隆抗体的制备
•   3.1 前言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验试剂与耗材
•     3.2.2 仪器设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 原核表达载体的构建
•     3.3.2 蛋白原核诱导表达
•     3.3.3 重组蛋白镍柱纯化
•     3.3.4 考马斯亮蓝检验纯化蛋白
•     3.3.5 重组蛋白透析纯化
•     3.3.6 纯化蛋白浓度测定
•     3.3.7 小鼠免疫
•     3.3.8 ELISA检验小鼠免疫效果
•     3.3.9 Western Blot实验
•     3.3.10 统计学分析
•   3.4 实验结果
•     3.4.1 GDS04的N基因原核表达质粒的构建
•     3.4.2 GDS04的N蛋白原核诱导和纯化
•     3.4.3 ELISA检验免疫小鼠效果
•     3.4.4 抗体特异性检验
•   3.5 小结与讨论
• 参考文献
• 附录 A 攻读硕士学位期间参与发表论文和专利
• 附录 B 中国树鼩两种新型乳头瘤病毒和一种新型多瘤病毒的检测与基因组鉴定
•   1 前言
•   2 实验材料
•     2.1 实验试剂与耗材
•     2.2 仪器设备
•   3 实验方法
•     3.1 病毒宏基因组测序
•     3.2 病毒RNA和 DNA基因组提取
•     3.3 病毒检测和基因组测序
•     3.4 T载体克隆
•     3.5 序列分析
•   4 实验结果
•     4.1 中国树鼩的PV和 PyV
•     4.2 TbelPV1和TbelPV2 基因组分析
•     4.3 TbelPV1和TbelPV2 的基因相似性和系统遗传学
•     4.4 TbelPyV1 基因组分析
•     4.5 TbelPyV1 蛋白序列相似性与系统发育
•   5 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘萍

导师: 葛行义

关键词: 先天免疫反应,干扰素反应,炎症反应

来源: 湖南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 湖南大学

分类号: R373

DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.001392

总页数: 76

文件大小: 1832K

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