Sedlin与RB1相互作用的机制研究

论文摘要

目的 构建脊椎骨骺发育不良蛋白Sedlin的缺失突变体和点突变体质粒,检测其在细胞内的表达、定位及其与RB1蛋白的共定位情况,并在此基础上进行了Sedlin突变体与RB1突变体相互作用研究,以及通过RNA干扰（siRNA和shRN A）技术探索Sedlin在哺乳动物细胞中的功能,及其对RB1参与细胞周期调控的影响。方法 以Sedlin全长cDNA序列为模板,扩增目的基因序列,连接至表达载体,构建3个原核表达质粒,即pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和相应的真核表达质粒,即pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F。分别单转pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F以及将上述质粒分别与pDNA3.1-FLAG-RB1/-N/-C共转到COS7细胞中,免疫荧光制片,观察其在真核细胞内的定位及共定位情况;制备GST-SedlinN融合蛋白,转染pDNA3.1-FLAG-RB1-N质粒至HEK 293T细胞,进行GST pulldown实验,探究二者在细胞外的相互作用情况;在HEK 293T细胞中共转pCDGFP-SedlinN和pDNA3.1-FLAG-RB1-N质粒,利用免疫共沉淀技术研究SedlinN与RB1-N在体内的相互作用情况;将Sedlin的siRNA转染骨肉瘤细胞U2OS以及慢病毒包装的Sedlin shRNA感染U2OS细胞,检测细胞周期相关蛋白RB1、P21、P27和P53等的表达情况。结果 测序的结果显示重组质粒pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F构建成功;免疫荧光结果显示,GFP-SedlinN/Y115A/Y115F蛋白在COS7细胞的细胞质和细胞核中均有分布,并与RB1蛋白存在明显的核内共定位,Sedlin-Y115A/Y115F蛋白与RB1-N蛋白以及SedlinN/Y115A/Y115F蛋白与RB1-C蛋白均存在共定位,但SedlinN蛋白与RB1-N蛋白不存在共定位。考马斯亮蓝染色显示融合蛋白GST-SedlinN/Y115A/Y115F在大肠杆菌BL21菌株中能够大量表达,Western blot结果显示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F在HEK 293T细胞中能够高效表达,GST pulldown和免疫共沉淀结果表明SedlinN蛋白与RB1-N蛋白在体内、体外均没有相互作用。RNA干扰实验结果显示细胞周期相关蛋白RB1、P21、P27和P53的表达受Sedlin蛋白表达水平的影响。结论 在COS7细胞中,Sedlin主要表达于细胞核,而Sedlin突变体除在细胞核中表达外,在细胞质中也有相当的量的表达,Sedlin及其突变体均与RB1蛋白共定位,显示Sedlin羧基端以及NPFY基序中的Y磷酸化与否并不影响其与RB1蛋白的共定位;SedlinN与RB1-N在COS7细胞中不存在共定位且在体外和胞内条件下均无相互作用,提示RB1可能通过其C端与Sedlin的N端结合,而Sedlin通过其C端与RB1的N端结合。抑制Sedlin的表达,影响RB1、P21、P27和P53等蛋白的表达水平,推测Sedlin可能位于这些基因的上游（如作为转录因子）,通过调控这些基因的表达从而参与对细胞周期的调控。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
•   参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 何叶

导师: 刘晓颖

关键词: 突变体,质粒构建,免疫荧光,干扰

来源: 安徽医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,口腔科学

单位: 安徽医科大学

分类号: Q23;R78

总页数: 61

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