应用CRISPR/Cas9技术构建人PTPN12基因敲除的A549稳定细胞株

论文摘要

PTPN12（Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 12）是编码人源PEST蛋白的基因,位于人常染色体7q11.23,在造血系统的相关细胞中高度表达,且主要表达在细胞质中。它由N端的催化结构域和C端的调节结构域组成,N端具有酪氨酸磷酸酶家族的高度保守特定基序,而亲水C端富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸,调节PEST与底物蛋白的相互作用。有研究表明,PTP-PEST通过对含有磷酸基团的信号分子的去磷酸化作用在细胞迁移、细胞增殖及细胞分化等生理过程中发挥着关键的作用。目前,研究者们发现PTPPEST蛋白水平的降低与已知的几种癌症相关,但有关PEST功能及PEST对肿瘤的发生发展的研究报道仍十分有限,需要进一步探讨PEST对肿瘤细胞的影响。CRISPR/Cas9是一项全新基因编辑技术,它具有高效率、高特异性、高精准度等优点,并且操作简单、快速,近年来迅速发展成为炙手可热的新方法。CRISPR/Cas9系统由CRISPR相关基因和Cas9核酸内切酶组成。利用与目的基因同源的sgRNA,特异性结合靶细胞基因组的DNA序列,形成杂合双链。Cas9蛋白可以对双链进行切割,使得DNA双链在靶位点处断裂。随后细胞通过非同源末端连接、同源重组修复等机制对断裂的双链进行修复,在断裂处插入异常碱基或使正常碱基缺失,从而导致移码突变,使蛋白不能正常翻译,最终实现目的基因的敲除。本文应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对人肺腺癌细胞A549中PTPN12基因进行了敲除,构建了PTPN12基因敲除的A549稳定细胞株,旨在研究PTPPEST的功能。首先根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别PTPN12基因第六个外显子相关序列的两个sgRNA（Single guide RNA）,构建PX458-PTPN12-sgRNA1和PX459-PTPN12-sgRNA2重组真核表达质粒。随后将两个重组质粒共转染至A549细胞中,培养得到稳定的单克隆细胞株。最后通过PCR、基因测序和Western Blot等方法对得到的单克隆细胞株进行鉴定,结果表明我们成功构建了PTPN12基因敲除的A549稳定细胞株。此外,我们为研究PTPN12的功能,对最终得到的PTPN12基因敲除的A549稳定细胞株进行了一系列体外实验。我们采用CCK-8和原位计数实验观察敲除PTPN12对A549细胞增殖的影响,结果均表明PTPN12的缺失加快了细胞的增殖。接下来用吉姆萨细胞染色和流式细胞术对细胞周期进行了分析,结果表明敲除PEST后,处于G2期的细胞增多,即促进了细胞分裂。最后我们利用细胞划痕实验验证了细胞迁移能力的变化,结果表明敲除A549细胞中的PTPN12基因后,细胞迁移能力增强。总之,我们成功建立了PTPN12基因敲除的A549稳定细胞株,为今后研究PTP-PEST的功能提供了基因敲除细胞模型。同时还通过一系列体外实验验证了PTPN12对细胞增殖和迁移能力的影响,结果表明PTPN12明显增强了细胞增殖和细胞迁移能力。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩写词
• 第1章 绪论
•   1.1 蛋白质磷酸酶的概述
•     1.1.1 蛋白质磷酸酶的概念及分类
•     1.1.2 PTP-PEST
•   1.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
•     1.2.1 CRISPR/Cas系统的组成
•     1.2.2 CRISPR/Cas9 作用原理
•     1.2.3 CRISPR/Cas9 技术应用
•   1.3 本课题的研究目的及意义
• 第2章 PTPN12 基因敲除A549 稳定细胞株的构建
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验试剂
•     2.1.2 菌株、载体和细胞培养
•     2.1.3 实验耗材与仪器设备
•     2.1.4 试剂配置
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 重组质粒的构建
•     2.2.2 细胞系的选择
•     2.2.3 A549 稳定细胞株的筛选
•     2.2.4 PTPN12 基因敲除A549 稳定细胞株的鉴定
•   2.3 结果及分析
•     2.3.1 重组质粒的构建
•     2.3.2 PTP-PEST在不同细胞系中的表达水平
•     2.3.3 PTPN12 基因敲除A549 稳定细胞株
•   2.4 本章小结
• 第3章 PTPN12 基因对A549 细胞增殖、迁移的影响
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验试剂
•     3.1.2 实验耗材与仪器
•     3.1.3 溶液配置
•     3.1.4 菌株、载体、细胞
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 细胞原位计数试验
•     3.2.2 CCK-8 细胞增殖的检测
•     3.2.3 吉姆萨细胞染色
•     3.2.4 细胞周期的检测
•     3.2.5 细胞划痕实验
•     3.2.6 统计学分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 细胞原位计数实验结果
•     3.3.2 CCK8 细胞增殖实验结果
•     3.3.3 吉姆萨细胞染色实验结果
•     3.3.4 细胞周期的检测结果
•     3.3.5 细胞划痕实验结果
•   3.4 本章小结
• 讨论
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄莫

导师: 付学奇

关键词: 细胞,细胞增殖,细胞迁移

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 吉林大学

分类号: Q78

总页数: 68

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