利用CRISPR/Cas9系统编辑水稻淀粉合成相关的SSIIIα与PPDK的定点突变研究

论文摘要

水稻是世界上主要的粮食作物,也是基因组研究的模式植物之一。成熟水稻种子的胚乳中,淀粉是主要的储藏物质。人在食用稻米之后,淀粉进入人体,血糖会急剧上升,会对糖尿病患者造成严重的身体负担。因此,关于改变水稻种子中淀粉含量的研究日渐成为科研人员的重要目标。本实验利用CRISPR/Cas9系统对水稻淀粉合成相关的基因进行定点编辑,得到以下结论:1.利用CRISPR/Cas9技术,我们成功地对水稻2个淀粉合成相关的基因SSⅢa（LOCOs08g09230）以及PPDK（LOCOs05g33570）进行基因的定点编辑。2.研究得到以下结果:SSⅢa得到3种类型的纯合突变体:（1）两个碱基AG的缺失;（2）一个碱基A的插入;（3）在靶点附近缺失347bp同时插入9bp（TGAGCTAAG）。PPDK得到3种类型的纯合突变体:（1）一个碱基T的插入;（2）三个碱基（GGG）缺失;（3）一个碱基A的缺失。3.对得到的纯合突变体进行转录水平的表达量分析,我们发现突变体编辑基因的表达量都低于野生型粳稻品种（嘉花1号）,而与淀粉合成相关的其它基因的表达量则出现不同程度的变化。ppdk突变体的有关淀粉合成的基因表达量存在5-10倍的下调,而ssⅢa突变体的SSⅠ及SSⅡ基因存在上调现象,而其他相关基因表达量降低或没有明显变化。4.对突变体成熟种子横切面进行冷场发射电子扫描显微镜观察,发现ppdk突变体以及ssⅢa-1突变体的淀粉颗粒形态和大小发生了明显的变化,并且千粒重也有了明显的降低。而ssⅢa-2突变体则没有观察到明显变化。5.对突变体进行I-KI染色,发现ppdk突变体较野生型颜色变浅,而ssⅢa突变体的颜色则变化不明显。6.对突变体种子中抗性淀粉含量的检测发现ppdk突变体的变化不明显,而ssⅢa突变体的抗性淀粉含量出现了大幅度提高。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功对水稻淀粉合成相关基因进行了定点编辑,为运用CRISPR/Cas9技术对功能型水稻的研究提供了实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   引言
•   1.1 水稻胚乳中淀粉的组成
•     1.1.1 淀粉的结构
•     1.1.2 抗性淀粉
•   1.2 胚乳中淀粉的合成途径
•   1.3 淀粉合成过程中相关的酶基因
•     1.3.1 ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）
•     1.3.2 颗粒型淀粉合成酶（GBSS）
•     1.3.3 可溶性淀粉合成酶（SS）
•     1.3.4 淀粉分支酶（SBE）
•     1.3.5 淀粉脱支酶（DBE）
•     1.3.6 丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）
•   1.4 基因编辑技术的研究进展
•     1.4.1 RNA干扰技术
•     1.4.2 ZFN技术
•     1.4.3 TALEN技术
•     1.4.4 CRISPR/Cas9 技术
•   1.5 本研究的目的意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 试验用水稻品种
•     2.1.2 菌种
•     2.1.3 载体
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 载体构建
•     2.2.2 制备遗传转化菌种
•     2.2.3 组织培养与遗传转化
•     2.2.4 转基因苗以及编辑植株的鉴定
•     2.2.5 qRT-PCR分析
•     2.2.6 编辑植株种子横切面的冷场发射电子扫描显微镜观察
•     2.2.7 对编辑植株种子进行I-KI染色
•     2.2.8 编辑植株部分农艺性状的调查分析
•     2.2.9 编辑植株的抗性淀粉和总淀粉含量测定
• 第3章 结果与分析
•   3.1 重组质粒的验证
•   3.2 To代阳性转基因植株检测
•   3.3 各基因靶位点突变类型鉴定
•   3.4 编辑植株中淀粉合成相关基因RNA表达水平
•   3.5 编辑植株种子的表型观察
•   3.6 编辑植株材料种子中淀粉颗粒结构观察以及I-KI染色情况分析
•   3.7 编辑植株抗性淀粉以及总淀粉含量分析
• 第4章 讨论与结论
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吴清清

导师: 林冬枝

关键词: 水稻,淀粉合成,突变体

来源: 上海师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 上海师范大学

分类号: S511;Q943.2

总页数: 59

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