IFN-α促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导记忆性Tfh细胞产生的研究

论文摘要

目的:本课题前期研究证实干扰素-α（Interferon-α,IFN-α）能够促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cell,Tfh）的分化和促进生发中心的形成,从而增强小鼠的体液免疫应答。研究证实,CD4+T细胞中存在长寿命记忆性Tfh细胞并主要负责激活IgG1型记忆B细胞,启动适应性免疫应答。但IFN-α是否能促进记忆性Tfh细胞的产生尚不清楚。因此,本研究通过体内实验明确IFN-α对FMD重组腺病毒疫苗诱导记忆性Tfh细胞分化及其功能的影响,初步探讨IFN-α促进FMD重组腺病毒疫苗诱导记忆性Tfh细胞分化的机制,为进一步研究IFN-α调控疫苗免疫的新机制提供理论数据。方法:1.将6-8周雌性BALB/c小鼠随机分为6组,每组20只,分别免疫腺病毒空载体（rAd）、表达FMDV VP1的重组腺病毒（rAd5VP1）、表达猪IFN-α的重组腺病毒（rAd5poIFN-α）、共表达FMDV VP1和猪IFN-α的重组腺病毒（rAd5VP1-2A-poIFN-α）、联合免疫rAd5VP1和rAd5poIFN-α（rAd5VP1+rAd5poIFN-α）以及猪O型口蹄疫灭活疫苗（inactivited vaccine）;间隔两周免疫一次,共免疫2次。分别在初次免疫后30天、60天、90天取小鼠脾脏,密度梯度离心法收获单个核细胞,采用流式细胞术检测CD4+CD44+活化T细胞、CD4+CD44+CD62L-记忆性T细胞、CD4+CXCR5+记忆性Tfh细胞的比例;流式细胞术检测CD38+B220+记忆性B细胞、CD38+B220+GL-7-IgG1+记忆性B细胞的比例。在初次免疫后90天流式细胞术检测Tfh细胞中趋化因子CXCR3、CCR6的表达。2.初次免疫90天后,对小鼠进行再次免疫,免疫前及免疫后3天做如下研究:2.1取小鼠脾脏,密度梯度离心法收获单个核细胞,采用流式细胞术检测CD4+CD44+活化T细胞、CD4+CD44+CD62L-记忆性T细胞、CD4+CXCR5+记忆性Tfh细胞的比例;Tfh细胞特征性转录因子Bcl-6的表达;Tfh细胞分泌细胞因子IL-21、IL-4、IFN-γ的表达水平;记忆性B细胞中协同共刺激分子CD86的表达水平。2.2取小鼠脾脏,密度梯度离心法收获单个核细胞,采用real-time PCR技术检测Tfh细胞相关转录因子STAT1、Bcl-6的表达水平。2.3取小鼠眼球血,分离血清,采用ELISA检测total IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b的分泌水平。结果:1.IFN-a促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导记忆性T细胞、记忆性Tfh细胞的产生。1.1小鼠免疫重组腺病毒30天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α组和rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4+CD44+细胞的比例明显高于rAd组,差异有统计学意义;rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4+CD44+细胞的比例明显高于rAd5VP1组,差异有统计学意义;CD4+CD44+细胞数量在60天持续存在,90天之后略有下降。1.2小鼠免疫重组腺病毒30天后,rAd5VP1+rAd5poIFN-α组和rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4+CD44+CD62L-细胞的比例明显高于rAd组,差异有统计学意义;CD4+CD44+CD62L-细胞数量在在60天持续存在,90天之后略有下降。1.3小鼠免疫重组腺病毒30天后,rAd5VP1+rAd5poIFN-α组和rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4+CXCR5+细胞的比例明显高于rAd组、rAd5VP1组以及rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4+CXCR5+细胞的比例明显高于inactivited vaccine组,差异有统计学意义;CD4+CXCR5+细胞数量在在60天持续存在,90天之后略有下降。1.4小鼠免疫重组腺病毒90天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1-2A-poIFN-α组Th1型Tfh细胞（CXCR3+CCR6-）的比例明显高于rAd组、rAd5VP1组、rAd5poIFN-α组以及inactivited vaccine组,差异有统计学意义;rAd5VP1+rAd5poIFN-α组Th1型Tfh细胞（CXCR3+CCR6-）的比例明显高rAd组,差异有统计学意义。rAd5VP1+rAd5poIFN-α组Th2型Tfh细胞（CXCR3-CCR6-）的比例明显高于rAd组、rAd5VP1组以及rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;rAd5VP1-2A-poIFN-α组Th2型Tfh细胞（CXCR3-CCR6-）的比例明显高于rAd组和rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;各组间Th17型Tfh细胞（CXCR3-CCR6+）数量无明显差异。2.IFN-a促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导记忆性B细胞的分化2.1小鼠免疫重组腺病毒30天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α组、rAd5VP1-2A-poIFN-α组和inactivited vaccine组CD38+B220+细胞的比例明显高于rAd组和rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;rAd5VP1组CD38+B220+细胞的比例明显高于rAd组,差异有统计学意义;CD38+B220+细胞数量在60天持续存在,90天之后略有下降。2.2小鼠免疫重组腺病毒30天后,rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD38+B220+GL-7-IgG1+细胞的比例明显高于rAd组、rAd5VP1组和rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;rAd5VP1+rAd5poIFN-α组CD38+B220+GL-7-IgG1+细胞的比例明显高于rAd5VP1组,差异有统计学意义;CD38+B220+GL-7-IgG1+细胞数量在60天持续存在,90天之后略有下降。3.小鼠再次免疫重组腺病毒对记忆性Tfh细胞以及体液免疫应答的影响3.1小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,流式细胞术检测结果显示:各组CD4+CD44+细胞、CD4+CD44+CD62L-细胞以及CD4+CXCR5+细胞的比例明显高于再免疫前,差异有统计学意义。3.2小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1组、rAd5VP1+rAd5poIFN-α组、rAd5VP1-2A-poIFN-α组和inactivited vaccine组Tfh细胞中IL-21的表达明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组有升高趋势,但无统计学差异。rAd5poIFN-α组、rAd5VP1+rAd5poIFN-α组和rAd5VP1-2A-poIFN-α组Tfh细胞中IFN-γ的表达明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组有升高趋势,但无统计学差异。各组Tfh细胞中IL-4的表达明显高于再免疫前,差异有统计学意义。3.3小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α组、rAd5VP1-2A-poIFN-α组记忆性B细胞表面协同共刺激分子CD86的表达明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组有升高趋势,但无统计学差异。3.4小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,ELISA结果显示:各组血清中total IgG、IgG1抗体的分泌水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;inactivited vaccine组血清中IgG2a抗体的分泌水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组无统计学差异。rAd5VP1+rAd5poIFN-α组、rAd5VP1-2A-poIFN-α组和inactivited vaccine组血清中IgG2b抗体的分泌水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组无统计学差异。4.IFN-a促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导转录因子Bcl-6、STAT1的表达。4.1小鼠免疫重组腺病毒90天后,流式细胞术检测结果显示:各组CXCR5+T细胞中转录因子Bcl-6的表达均明显高于CXCR5-T细胞,差异有统计学意义。4.2小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,流式细胞术检测结果显示:rAd组、rAd5VP1组、rAd5poIFN-α组、rAd5VP1+rAd5poIFN-α组以及rAd5VP1-2A-poIFN-α组Tfh细胞（CXCR5+Bcl-6+）数量比例明显高于再免疫前,差异有统计学意义;inactivited vaccine组Tfh细胞（CXCR5+Bcl-6+）数量比例有升高趋势,但无统计学差异。4.3小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,real-time PCR检测结果显示:各组STAT1 mRNA的表达水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;rAd组、rAd5VP1组、rAd5poIFN-α组、rAd5VP1+rAd5poIFN-α组以及rAd5VP1-2A-poIFN-α组Bcl-6 mRNA的表达水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;inactivited vaccine组Bcl-6 mRNA的表达水平相比于再免疫前有升高趋势,但无统计学差异。结论:IFN-α作为口蹄疫重组腺病毒疫苗的免疫调节剂,能够增强重组腺病毒疫苗诱导记忆性T细胞、记忆性Tfh细胞、记忆性B细胞的分化,增强Tfh细胞趋化因子（CXCR3,CCR6）的表达;促进细胞因子（IL-21,IL-4,IFN-γ）及抗体的分泌;再次免疫后,IFN-α促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导的Tfh细胞发挥免疫功能,IFN-α可能通过提高转录因子STAT1的表达促进Bcl-6的表达,进而促进Tfh细胞的分化。为进一步研究IFN-α调控疫苗免疫的新机制提供理论数据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
•   综述参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 个人简介
• 开题、中期及学位论文答辩委员组成

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙鹏

导师: 苏春霞,段相国

关键词: 口蹄疫重组腺病毒疫苗,免疫记忆,记忆性细胞

来源: 宁夏医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 宁夏医科大学

分类号: R392

总页数: 68

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