氧化性低密度脂蛋白介导NF-κB信号通路促进rBMSCs成骨分化的机制研究

论文摘要

氧化型低密度脂蛋白（oxidized Low density Lipoprotein,oxLDL）及其中的生理活性磷脂是动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）发生的主要始动因素。已研究证明动脉粥样硬化发生发展过程中间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）参与调控。但是迄今为止,动脉粥样硬化的发生发展过程中ox-LDL对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖及成骨分化等生物学功能的影响及作用机制研究较少。因此,本研究试图揭示ox-LDL在BMSCs的增殖及成骨分化过程中的作用及其分子机理。为了证明ox-LDL对BMSCs的直接作用,我们用大鼠骨髓间充质干细胞（Rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）建立体外培养及其诱导分化体系。首先利用全骨髓贴壁法进行rBMSCs的分离纯化,并用流式细胞仪进行检测其表面标记蛋白CD73,CD90,CD106的表达,进而做了向成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞诱导分化实验,验证其多向分化的潜能。此基础上,我们混合ox-LDL和成骨诱导液对rBMSCs进行培养,并通过碱性磷酸酶活性和钙沉积情况进行成骨检测。结果发现ox-LDL促进rBMSCs的成骨分化,并具有添加剂量和作用时间依赖性。为了阐明ox-LDL促进rBMSCs的成骨分化的机制,我们进行转录组测序。结果显示NF-κB信号通路等20多个信号通路显著变化。相关研究报道及课题组前期实验结果显示,NF-κB信号通路在动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用。但是NF-κB信号通路在ox-LDL促进rBMSCs的成骨分化过程中的分子机制尚未得到充分的理解。因此为了阐明这个问题,我们聚焦于研究与NF-κB信号通路相关的三个补体NF-κB-p65,uPAR,C5aR的表达变化及其功能。荧光定量PCR和Western blot实验结果显示,BMSCs向成骨分化过程中,NF-κB-p65,uPAR,C5aR的表达显著上调,与RNA-seq测序结果一致。接下来我们添加C5aR补体特异性拮抗剂进行成骨诱导实验。结果发现,能显著抑制rBMSCs向成骨细胞分化能力。荧光定量PCR和Western blot实验结果显示,C5aR、uPAR、NF-κBp65的表达量均下调。然而,换用NF-κB-p65拮抗剂进行成骨诱导实验也得到了同样的结果。以上研究说明:NF-κB信号通路在BMSCs向成骨细胞分化的过程中发挥重要作用。近来多项研究报道显示,组蛋白修饰在MSCs成骨分化过程中也起着重要作用。因此,我们聚焦于组蛋白H3K27三甲基化修饰在成骨分化的rBMSCs基因组中的动态变化和作用。Western blot实验结果显示,rBMSCs向成骨分化过程中组蛋白去甲基化酶JMJD3表达显著上调,并且特异性地降低H3K27me3的甲基化水平。接下来用NF-κB和C5aR特异性拮抗剂干预处理细胞后发现,JMJD3表达显著下调,H3K27me3修饰水平明显升高。以上研究说明:NF-κB信号通路可以通过调控组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达促进rBMSCs的成骨分化。我们的研究结果表明,在ox-LDL介导的高脂体外培养环境中,NF-κB-Jmjd3信号通路激活促进rBMSCs的成骨分化。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词中英文对照表
• 一 间充质干细胞生物学特性的研究进展
•   1 MSCs的发展历程
•   2 MSCs的生物学特性
•     2.1 MSCs的增殖
•     2.2 MSCs的多向分化潜能
•       2.2.1 成脂分化
•       2.2.2 软骨分化
•       2.2.3 成骨分化
•     2.3 MSCs的归巢
•     2.4 MSCs的免疫调节
•   3 MSCs的临床研究及应用
• 二 ox-LDL对 rBMSCs成骨分化机制的影响
•   1 绪论
•   2 实验材料与溶液配制
•     2.1 实验动物
•     2.2 实验仪器
•     2.3 主要的试剂及耗材
•     2.4 细胞培养液配置
•   3 实验方法
•     3.1 r BMSCs的分离和培养
•       3.1.1 细胞的原代分离
•       3.1.2 细胞传代
•       3.1.3 细胞冻存
•       3.1.4 细胞复苏
•     3.2 r BMSCs的鉴定
•       3.2.1 细胞表面标志物的检测
•       3.2.2 r BMSCs的三向分化
•     3.3 ox-LDL对细胞成骨以及成骨信号通路的影响
•       3.3.1 MTS检测细胞增殖能力
•       3.3.2 碱性磷酸酶活力检测
•     3.4 检测细胞核酸水平的表达量
•       3.4.1 RNA提取
•       3.4.2 反转录RNA反应（在冰上操作）
•     3.5 检测细胞蛋白水平的表达量
•       3.5.1 总蛋白提取（冰上进行）
•       3.5.2 BCA法蛋白定量
•       3.5.3 蛋白质免疫印迹（Western Bolt）
•     3.6 转录组测序（RNA—Seq检测）
•   4 实验结果与分析
•     4.1 r BMSCs的分离培养与鉴定
•       4.1.1 r BMSCs的体外分离与原代培养
•       4.1.2 流式细胞仪检测r BMSCs的表面标志蛋白的表达
•       4.1.3 r BMSCs三向分化潜能的鉴定
•     4.2 氧化性低密度脂蛋白促进r BMSCs的成骨分化
•       4.2.1 ox-LDL对 r BMSCs增殖能力的影响
•       4.2.2 ox-LDL对钙沉积的影响
•       4.2.3 ox-LDL对碱性磷酸酶活性（ALP）的影响
•     4.3 基于高通量测序实验方法探索分子机制
•       4.3.1 GO功能注释分析
•       4.3.2 KEGG功能注释分析
•       4.3.3 差异基因表达分析结果
•     4.4 ox-LDL对 r BMSCs成骨信号通路的影响
•       4.4.1 各基因的表达水平
•       4.4.2 NF-κB-p65和C5aR特异性拮抗剂对r BMSCs成骨分化的影响
•     4.5 ox-LDL介导组蛋白甲基化修饰调控r BMSCs的成骨分化
•       4.5.1 ox-LDL对 r BMSCs组蛋白H3K27me3 修饰水平的影响
•       4.5.2 NF-κB-P65和C5aR补体特异性拮抗剂对H3K27me3 修饰水平的影响
•   5 讨论
•   6 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王雅琴

导师: 陈晓春,王长山

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 内蒙古大学

分类号: R329.2

DOI: 10.27224/d.cnki.gnmdu.2019.000079

总页数: 89

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