霍乱弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

论文摘要

为建立一种基于TaqMan探针法定量检测霍乱弧菌的三重荧光定量PCR方法,以霍乱弧菌种特异性基因ompW和毒力基因ctx、hly为靶基因,分别设计特异性引物及相应的TaqMan探针。在ompW、ctx、hly探针的5’端分别标记CY5、FAM、HEX荧光报告基团,3’端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示,本试验建立的三重荧光定量PCR方法与其他菌株无交叉反应,其最低检出限达到了10 CFU/m L,重复性试验中每组变异系数均小于1.4%;检测人工染菌的虾肉和贝类样品时,最低检出限也达到1×102CFU/m L。结果表明,本实验室建立的三重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,是高通量检测致病性霍乱弧菌的有效手段。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 菌株
•   1.2 主要试剂与仪器
•   1.3 引物及探针的设计与合成
•   1.4 重组质粒标准品的制备
•   1.5 霍乱弧菌三重实时荧光定量PCR检测方法的建立
•     1.5.1 三重荧光定量PCR反应体系及条件的确定
•     1.5.2 三重实时荧光定量PCR标准曲线
•     1.5.3 三重实时荧光定量PCR的特异性
•     1.5.4 三重实时荧光定量PCR的敏感性
•     1.5.5 三重实时荧光定量PCR的重复性
•   1.6 人工染菌虾和贝类样品的检测
• 2 结果与分析
•   2.1 目的片段的PCR扩增与重组质粒的PCR鉴定
•   2.2 霍乱弧菌三重荧光定量PCR检测方法的建立
•     2.2.1 三重荧光定量PCR反应体系及条件的确定mix Ex Taq （2×）12.5 L, ROX Reference DyeII
•     2.2.2 三重荧光定量PCR标准曲线的绘制
•     2.2.3 三重荧光定量PCR的特异性
•     2.2.4 三重荧光定量PCR的敏感性
•     2.2.5 霍乱弧菌三重荧光定量
•     2.2.6 人工染菌虾和贝类样品的检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 万莹,陈永军,任亚玲,王亚磊,王权,蒋蔚

关键词: 霍乱弧菌,三重荧光定量

来源: 中国兽医科学 2019年09期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院上海兽医研究所

基金: 上海市科学技术委员会科研计划项目（17140900400）,国家重点研发计划项目（2017YFC1200201）

分类号: S852.61

DOI: 10.16656/j.issn.1673-4696.2019.0154

页码: 1143-1151

总页数: 9

文件大小: 2279K

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