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人乳头瘤病毒39/68/70型交叉疫苗研究

2020-12-02阅读(636)

人乳头瘤病毒39/68/70型交叉疫苗研究

论文摘要

持续感染高危型的人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）能引发黏膜组织上皮恶性病变,是引起女性宫颈癌的主要诱因。流行病学调查研究显示,宫颈癌已成为危害女性健康的第四大癌症。在中国乃至全球范围内,宫颈癌病例均呈现逐年上升态势。HPV的结构蛋白包括主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2。L1蛋白可在体外表达并在一定的环境中组装成类病毒颗粒（virus like particles,VLPs）,其表面保留了与天然HPV病毒颗粒相似的结构。目前已上市的HPV预防性疫苗均基于VLPs形式研发,其能诱导机体产生中和抗体,有效抵抗HPV感染。由于HPV疫苗具有严格的型特异性,其免疫后难以产生高滴度的型交叉中和抗体。目前,默克公司生产的HPV九价疫苗只能预防7种高危型HPV感染,保护率为90%。而HPV型别众多,能引发恶性肿瘤的至少有15种。为了预防更多型别HPV的感染,需要在现有疫苗基础上引入更多型别的VLPs,但是,这会导致疫苗生产成本激增、生产工艺更加复杂以及带来疫苗安全隐患等问题。因此,使用较少型别的VLPs预防更多型别的HPV感染（“一防多”）是下一代HPV预防性疫苗研究的方向。基于上述问题,本研究分析HPV L1蛋白亲缘关系,采用近缘间HPV L1表位移植策略构建嵌合型HPV L1 VLPs,对其进行全面的性质鉴定及免疫评价工作,筛选能诱导高滴度交叉中和抗体的候选疫苗分子,探索嵌合VLPs疫苗实现“一防多”的可行性。根据IARC（International Agency for Research on Cancer）致癌性分类,HPV39、HPV68、HPV70分别属于1类致癌物、2A类致癌物和2B类致癌物。流行病学统计表明,有3%的宫颈癌病例是由HPV39、HPV68和HPV70这三个型别的感染引起的。在我国,HPV39、HPV68的感染率为3-5%,HPV70的感染率为1%左右。因此,为了扩大疫苗保护范围,本研究以亲缘关系较近的HPV39、HPV68、HPV70三个高危型别为研究对象构建型交叉疫苗候选分子。首先,构建HPV39、HPV68和HPV70三个型别VLPs和假病毒,并对HPV39、HPV68和HPV70 VLPs进行理化性质和免疫原性检测,结果显示其VLPs形态规则,为T=7的二十面体结构;免疫原性分析结果显示三个型别VLPs均能诱导高滴度的中和抗体,具有良好的免疫原性。进一步,将HPV39、HPV68和HPV70中亲缘关系较近的HPV39和HPV68两型作为骨架构建HPV39/68和HPV68/39嵌合分子并表达纯化,利用SDS-PAGE、TEM、HPLC和AUC等方法进行理化性质检测并免疫小鼠,免疫血清中和检测显示两型嵌合蛋白中H39-68FG VLPs和H68-39BC VLPs诱导产生针对HPV39和HPV68的中和抗体滴度与野生型相当。再以H39-68FG VLPs和H68-39BC VLPs为骨架,构建HPV39/68/70三型嵌合蛋白,使用相同的方法进行理化性质分析并免疫小鼠,并结合ED5o检测方法筛选出H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HIVLPs两个能诱导高滴度三型交叉中和抗体的嵌合蛋白,其具有良好的热稳定性,可作为候选分子在后续疫苗研制中进一步评价。其次,利用HPV68 VLPs和HPV70 VLPs筛选的单克隆抗体对H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HI VLPs进行表位分析。将HPV68和HPV70的型特异单抗与H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HI VLPs进行ELISA检测,其中HPV68单抗9F4和HPV70单抗12B1 1与H39-68FG-70HI VLPs候选分子具有较高的结合活性,与野生型VLPs结果相当。这表明通过表面环区同源替换的方法能成功将HPV68和HPV70的表位移植至HPV39 L1 VLPs中,后续可进一步解析H39-68FG-70HI VLPs与9F4 Fab和12B11 Fab的免疫复合物结构,阐述其表位信息。综上,本研究通过HPV L1近缘表位替换构建了HPV39/68/70三型嵌合疫苗分子并在大肠杆菌中成功表达,其纯度高、颗粒形态规则且均一性好,利用小鼠免疫评价实验筛选出具有理想交叉保护效果的候选疫苗分子,实现了一种VLPs预防三种高危型别HPV的效果,为下一代HPV预防性疫苗研制奠定基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词
  • 第一章 前言
  •   1 HPV简介
  •     1.1 HPV基因组及编码蛋白
  •     1.2 HPV分型
  •     1.3 HPV感染及流行病学
  •   2 HPV衣壳蛋白结构研究进展
  •     2.1 HPV五聚体晶体结构研究进展
  •     2.2 HPV VLPs冷冻电镜三维结构研究进展
  •   3 HPV衣壳蛋白中和表位研究进展
  •     3.1 HPV抗原表位研究方法
  •     3.2 HPV L1表位研究进展
  •     3.3 HPV L2表位研究进展
  •     3.4 基于中和表位的HPV型交叉疫苗研究进展
  •   4 HPV预防性疫苗研究进展
  •     4.1 已上市HPV疫苗
  •     4.2 其他HPV疫苗
  •     4.3 现有预防性疫苗存在的问题
  •   5 研究目的与意义
  • 第二章 材料和方法
  •   1 实验材料
  •     1.1 仪器
  •     1.2 基因、菌株和质粒
  •     1.3 单抗、实验动物和酶
  •     1.4 细胞培养常用试剂
  •     1.5 其他耗材和试剂
  •   2 实验方法
  •     2.1 常见溶液及培养基的配置
  •     2.2 分子克隆相关生物学实验方法
  •     2.3 表达纯化和性质鉴定
  •     2.4 细胞培养相关实验
  •     2.5 病毒制备及相关实验方法
  •     2.6 抗体性质相关研究方法
  •     2.7 结构解析
  • 第三章 结果与分析
  •   第一部分: HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒疫苗研制
  •     1 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒制备
  •       1.1 HPV39型、HPV68型、HPV70型表达载体构建
  •       1.2 HPV39型、HPV68型、HPV70型病毒样颗粒表达鉴定
  •       1.3 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒纯化与组装
  •     2 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒的性质研究
  •       2.1 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒理化性质研究
  •       2.2 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒免疫原性研究
  •     3 第一部分小结
  •   第二部分: HPV39/68两型型变叉疫苗研究
  •     1 HPV39/HPV68/HPV70亲缘关系分析对比
  •     2 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒制备
  •       2.1 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒表达载体构建
  •       2.2 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒表达鉴定
  •       2.3 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒纯化与组装
  •     3 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒的性质研究
  •       3.1 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒理化性质研究
  •       3.2 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒免疫原性研究
  •     4 第二部分小结
  •   第三部分: HPV39/68/70三型型交叉疫苗研究
  •     1 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒制备
  •       1.1 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒表达载体构建
  •       1.2 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒表达鉴定
  •       1.3 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒纯化与组装
  •     2 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒的性质研究
  •       2.1 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒理化性质研究
  •       2.2 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒免疫原性研究
  •       2.3 HPV39/68/70三型候选分子热稳定性评估
  •       2.4 HPV39/68/70三型候选分子抗原性分析
  •     3 第三部分小结
  •   第四部分 :H39-68FG-70DE与H39-68FG-70HI三型候选交叉疫苗分子中和表位研究
  •     1 HPV39/68/70型特异中和抗体性质研究
  •       1.1 HPV68型、HPV70型中和抗体筛选
  •       1.2 HPV68型、HPV70型中和抗体的性质鉴定
  •     2 H39-68FG-70DE与H39-68FG-70HI三型候选型交叉疫苗分子表位分析
  •       2.1 HPV68与HPV70型特异中和抗体的筛选
  •       2.2 基于HPV39/68/70型特异中和抗体单抗盘分析三型候选型交叉疫苗分子中和表位
  •     3 第四部分小结
  • 第四章 讨论
  •   1 型交叉疫苗在HPV疫苗中的应用前景
  •   2 型交叉疫苗免疫评价
  •   3 型交叉免疫机制
  •   4 HPV结构研究
  • 小结与展望
  • 参考文献
  • 在校期间科研成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 杨与柔

    导师: 李少伟

    关键词: 人乳头瘤病毒,中和抗体,型交叉疫苗

    来源: 厦门大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 厦门大学

    分类号: R392

    总页数: 122

    文件大小: 6575K

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