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中华按蚊与溴氰菊酯抗性相关ABC转运蛋白基因的鉴定、筛选及功能研究

2020-12-02阅读(293)

中华按蚊与溴氰菊酯抗性相关ABC转运蛋白基因的鉴定、筛选及功能研究

论文摘要

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP—binding cassette transporter）,ABC转运蛋白)是一类广泛存在于古细菌、细菌和真核生物中的膜蛋白。ABC转运蛋白可以参与多种内外源有毒物质的吸收、积累和排泄,在机体组织防御过程中起着重要作用,与动物或昆虫的抗药性密切相关。中华按蚊是疟疾和马来丝虫病的重要传播媒介,广泛分布于东亚及东南亚地区。由于拟除虫菊酯类杀虫剂（尤其是溴氰菊酯）的广泛使用,中华按蚊对该类药物的抗性已日趋严重,成为蚊虫防治的主要障碍。目前,尚无关于中华按蚊ABC转运蛋白基因及其与溴氰菊酯抗性的研究报道。本研究拟通过生物信息学分析方法,对中华按蚊基因组数据库中潜在的ABC转运蛋白基因进行鉴定、并对其命名、结构域、基因结构、scaffold分布和系统发育等进行研究,为进一步研究中华按蚊ABC转运蛋白基因的功能提供重要的信息基础。通过RNA-seq和qPCR对中华按蚊中与溴氰聚酯抗性相关ABC转运蛋白基因进行筛选,采用RNAi、ATPase活性检测以及分子对接对筛选基因进行功能学研究。本文的主要研究内容和结果包括:（1）基于中华按蚊基因组数据,我们在中华按蚊中鉴定出61个ABC转运蛋白基因。根据ABC转运蛋白NBD序列的同源性,将它们分为8个亚家族,并对每个成员进行了系统命名。ABC转运蛋白基因的结构域组成形式多样,包括全分子、不完全分子、半分子以及四分之一的ABC转运蛋白基因。ABCG亚家族含有21个成员,是中华按蚊ABC亚家族中数量最多的一个,占总ABC转运蛋白基因的34%。ABCE亚家族仅含有1个ABC转运蛋白基因,是中华按蚊中数量最少的亚家族。系统进化分析发现,ABCB、ABCD、ABCE、ABCF和ABCH是中华按蚊中进化较为保守的亚家族,各亚家族基因与冈比亚按蚊和黑腹果蝇基因成对应的直系同源关系;ABCA、ABCC和ABCG亚家族基因与冈比亚按蚊ABC转运蛋白基因有明显的直系同源关系,而且ABCC和ABCG亚家族经历了基因复制事件。（2）利用RNA-seq技术,我们对三个野外抗性种群（AH-FR、CQ-FR和YN-FR）和一个实验室敏感品系（WL-LS）的所有ABC转运蛋白基因表达水平进行了分析比较。结果显示,有6个基因（AsABCG28、AsABCA5、AsABCC9、AsABCC11、AsABCG7和AsABCG23）至少在一个抗性种群中存在显著表达差异。其中,AsABCG28是唯一一个在三个种群中均显著上调的基因。qPCR结果显示,溴氰菊酯处理中华按蚊成蚊6 h后,三个ABCB基因（AsABCB1、AsABCB3和AsABCB5）显著上调表达,而AsABCG28基因在处理后12和24 h,均表现为显著上调表达。（3）通过T7试剂盒体外合成AsABCG28同源的特异dsRNA,采用饲喂法导入2日龄中华按蚊幼虫体内。qPCR结果显示,AsABCG28基因的表达量显著降低,AsABCG28基因沉默能显著提高溴氰菊酯引起中华按蚊幼虫的致死率。（4）采用质粒pPICZA构建重组质粒AsABCG28/pPICZA,线性化后电转化毕氏酵母Pichia pastrois GS115,通过Zeocin抗生素筛选得到高拷贝重组子。甲醇诱导表达24 h后收集菌体,通过组织研磨法、超速离心法及镍亲和层析法相结合纯化目标产物,每1 L发酵液可获得0.1 mg重组蛋白AsABCG28,其ATPase活性为25nmol/mg/min。在测定浓度范围内（0-1 mM）,溴氰菊酯对重组蛋白AsABCG28ATPase活性无诱导作用,而溴氰菊酯代谢产物3-苯氧基苯甲酸对ATPase活性具有显著诱导作用,且呈剂量效应关系。分子对接结果显示,3-苯氧基苯甲酸能够很好的结合在AsABCG28的TMD结构域上,结合自由能为-29.4036 kcal/mol;3-苯氧基苯甲酸羟基氧与AsABCG28的Val431形成氢键,键长为2.8?。总之,本研究为了解ABC转运蛋白基因亚家族成员提供了基础信息框架,为更好地了解和深入研究ABC转运蛋白基因在溴氰菊酯抗性中的作用奠定了重要基础。AsABCG28基因与溴氰菊酯抗性密切相关,主要通过转运溴氰菊酯代谢产物3-苯氧基苯甲酸,减少其在体内的积累,从而提高蚊虫对溴氰菊酯的抗性。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩略词对照表
  • 1 绪论
  •   1.1 研究背景与意义
  •   1.2 国内外研究现状
  •     1.2.1 ABC转运蛋白结构
  •     1.2.2 ABC转运蛋白的作用机制
  •     1.2.3 ABC转运蛋白各亚家族研究进展
  •     1.2.4 ABC转运蛋白转运外源物质的检测方法和技术
  •     1.2.5 ABC转运蛋白在外源物质转运和抗药性中的作用
  •   1.3 研究目的、研究内容及创新性
  •     1.3.1 课题研究目的
  •     1.3.2 课题研究内容
  •     1.3.3 课题研究的技术路线
  •     1.3.4 课题的特色及创新点
  • 2 中华按蚊ABC转运蛋白基因家族鉴定、特征及系统进化分析
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与方法
  •     2.2.1 数据来源
  •     2.2.2 分析软件
  •     2.2.3 中华按蚊ABC转运蛋白基因鉴定
  •     2.2.4 中华按蚊ABC转运蛋白基因特征分析
  •     2.2.5 中华按蚊ABC转运蛋白基因系统发育分析
  •     2.2.6 同义替换和非同义替换检测
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 中华按蚊ABC转运蛋白基因多样性及基因组定位
  •     2.3.2 中华按蚊ABC转运蛋白基因系统进化与特征
  •     2.3.3 中华按蚊ABC转运蛋白基因的Ka/Ks
  •   2.4 本章小结
  • 3 中华按蚊与溴氰菊酯抗性相关ABC转运蛋白基因的筛选
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料与试剂
  •     3.2.1 实验材料
  •     3.2.2 主要实验试剂
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 转录组测序样本的制备
  •     3.3.2 中华按蚊总RNA的提取
  •     3.3.3 总RNA浓度、纯度检测及完整性鉴定
  •     3.3.4 中华按蚊ABC转运蛋白基因表达谱分析
  •     3.3.5 qPCR验证
  •     3.3.6 溴氰菊酯处理后ABC转运蛋白基因的表达谱分析
  •   3.4 实验结果与讨论
  •     3.4.1 野外抗性种群ABC转运蛋白基因表达谱分析
  •     3.4.2 显著差异表达ABC转运蛋白基因的q PCR验证
  •     3.4.3 溴氰菊酯处理后中华按蚊ABC转运蛋白基因表达谱分析
  •   3.5 本章小结
  • 4 RNA干扰AsABCG28 基因表达对溴氰菊酯处理后中华按蚊致死率的影响
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料与试剂
  •     4.2.1 实验材料
  •     4.2.2 主要实验试剂
  •     4.2.3 实验耗材及试剂准备
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 中华按蚊总RNA的提取、浓度、纯度及完整性鉴定
  •     4.3.2 cDNA的合成
  •     4.3.3 AsABCG28 基因片段的扩增
  •     4.3.4 目的片段的回收
  •     4.3.5 PCR产物的T/A克隆
  •     4.3.6 感受态细胞的制备
  •     4.3.7 连接产物的转化
  •     4.3.8 阳性菌的筛选及测序
  •     4.3.9 质粒DNA的提取
  •     4.3.10 AsABCG28-及GFP-dsRNA的合成
  •   4.4 实验结果与讨论
  •     4.4.1 中华按蚊总RNA的浓度及完整性检测
  •     4.4.2 AsABCG28/pGEM-T重组质粒的构建
  •     4.4.3 dsRNA的合成
  •     4.4.4 RNAi对中华按蚊幼虫AsABCG28 基因表达及溴氰聚酯处理中华按蚊幼虫死亡率的影响
  •   4.5 本章小结
  • 5 AsABCG28 在毕氏酵母中的表达及其参与溴氰菊酯代谢研究
  •   5.1 引言
  •   5.2 实验材料与试剂
  •     5.2.1 实验材料
  •     5.2.2 实验主要试剂及配置方法
  •   5.3 实验方法
  •     5.3.1 重组质粒AsABCG28/p PICZA的构建及鉴定
  •     5.3.2 重组质粒线性化
  •     5.3.3 重组质粒电转化导入毕氏酵母
  •     5.3.4 毕氏酵母阳性克隆菌的鉴定
  •     5.3.5 毕氏酵母重组子的诱导表达
  •     5.3.6 表达产物的分离纯化
  •     5.3.7 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
  •     5.3.8 ATP酶活性检测
  •     5.3.9 不同药物对AsABCG28 ATPase活性的影响
  •     5.3.10 AsABCG28 同源建模及分子对接
  •   5.4 实验结果与讨论
  •     5.4.1 重组质粒AsABCG28/p PICZA的鉴定及线性化
  •     5.4.2 酵母菌GS115 重组子的筛选与鉴定
  •     5.4.3 重组蛋白AsABCG28 的诱导表达
  •     5.4.4 重组蛋白AsABCG28 的分离纯化
  •     5.4.5 AsABCG28 参与溴氰菊酯代谢研究
  •     5.4.6 AsABCG28 同源建模与评估
  •     5.4.7 AsABCG28 与药物的分子对接
  •   5.5 本章小结
  • 6 结论与展望
  •   6.1 主要结论
  •   6.2 后续工作展望
  • 参考文献
  • 附录
  •   A.作者在攻读博士期间发表的论文
  •   B.作者在攻读博士期间参加科研项目情况
  •   C.作者在攻读博士期间取得的科研成果
  •   D.附表
  •   E.学位论文数据集
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 和七一

    导师: 陈斌

    关键词: 中华按蚊,转运蛋白,溴氰菊酯,苯氧基苯甲酸

    来源: 重庆大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 重庆大学

    分类号: Q963

    DOI: 10.27670/d.cnki.gcqdu.2019.001582

    总页数: 116

    文件大小: 5340k

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