杜仲EuABCF1基因克隆及表达分析

论文摘要

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是杜仲科杜仲属植物,是中国特有的名贵药材,药用历史悠久,在临床上有着广泛的应用,杜仲具有很高的经济价值和科学研究价值,但目前对杜仲的生长发育机制还未充分认识。ABC转运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters）,是植物体内多种物质跨膜转运的主要载体,是活细胞新陈代谢不可或缺的主要成分,分为八大亚族（A-H）,是目前已知最大、最古老的蛋白家族之一。为了揭示杜仲ABC转运蛋白编码基因对杜仲生长发育的调节作用及ABC转运蛋白F亚家族基因表达特征和功能,本研究参考本实验室构建的杜仲转录组数据库,利用PCR克隆ABC转运蛋白基因EuABCF1,并进行生物信息学及表达特征分析,取得如下主要结果。1杜仲EuABCF1基因克隆及生物信息学分析基于本实验室前期构建的杜仲转录组数据库,筛选获得ABC转运蛋白同源序列。根据其编码的cDNA序列设计特异性引物,以杜仲cDNA为模板,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术克隆到全长为1416 bp的ORF序列,经测序和注释比对,该序列为一个ABC转运蛋白基因序列,命名为EuABCF1。生物信息学分析结果表明,该序列编码471个氨基酸;分子量为54.05378 kD;理论等电点pI为5.81;属于不稳定的亲水性蛋白;亚细胞定位预测在细胞核中;含有ABC转运蛋白F亚家族保守结构域,不含跨膜域和信号肽,符合ABC转运蛋白F亚家族基因结构特征。二级结构分析表明,ɑ螺旋（Alpha helix）占53.50%,β折叠（Beta turn）占5.94%,无规则卷曲（Random coil）占25.69%,延伸链（Extended strand）占14.86%;进化树分析表明,杜仲EuABCF1蛋白在进化过程中与月季（Rosa chinensis）的ABC转运蛋白F亚家族EuABCF1蛋白亲缘性较近。2杜仲EuABCF1基因表达分析运用qRT-PCR技术分析了杜仲不同发育时期根、茎、叶和雄花中EuABCF1的表达量,以探索杜仲EuABCF1基因在杜仲中的表达特征,结果表明,EuABCF1基因在各个部位均有表达,表达量有较明显的差异,表现出组织特异性,尤其在雄花中表达量最高,推测该基因在花发育中具有重要作用。EuABCF1基因在杜仲幼苗和成年028M雄株当年生四月幼根、幼茎、叶片中的表达量进行显著性分析,结果表明,成年028M雄株幼茎极显著高于幼苗幼茎（P<0.01）,成年028M雄株叶片与幼苗叶片表达量差异不显著（P>0.01）,成年028M雄株幼根极显著高于幼苗幼根（P<0.01）;在同一发育时期,EuABCF1基因表达量在幼苗中叶片极显著高于幼茎、幼根,在成年028M雄株幼茎中的表达量极显著高于成株叶片（P<0.01）。由以上结果推测EuABCF1基因对杜仲不同时期不同部位生长发育具有重要作用,尤其在雄花发育中有必不可少的作用。3外源处理对EuABCF1基因的诱导为了探究EuABCF1基因是否受400μmol·L-1IAA、120μmol·L-1GA3和100μmol·L-1MeJA及4℃低温胁迫的诱导表达,本试验采用外源IAA、GA3和MeJA处理及低温胁迫杜仲幼苗,利用Real-time-PCR技术检测EuABCF1基因表达量,进而初步推测EuABCF1蛋白的功能。结果表明,与处理前相比,400μmol·L-1IAA和100μmol·L-1MeJA诱导下EuABCF1基因在杜仲叶片中的相对表达量增加;4℃低温胁迫下,EuABCF1基因在杜仲叶片中的相对表达量呈现先抑制后促进的趋势;而120μmol·L-1GA3处理对杜仲叶片中EuABCF1基因相对表达量没有显著影响（P>0.01）。研究结果表明EuABCF1基因表达受400μmol·L-1IAA和100μmol·L-1MeJA及4℃低温诱导,进而推测EuABCF1蛋白可能直接或间接的参与生长素、茉莉酸甲酯信号转导调控杜仲的生长发育过程,并参与杜仲抗寒过程。综上所述,EuABCF1基因受实验浓度MeJA和IAA诱导,对杜仲不同时期不同部位的生长发育及抗寒胁迫响应过程可能具有显著作用。

论文目录

• 资助项目
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1 杜仲简介
•     1.1 杜仲的形态特征
•     1.2 杜仲的应用价值
•   2 ABC转运蛋白研究
•     2.1 ABC转运蛋白的发现
•     2.2 ABC转运蛋白结构
•     2.3 植物ABC转运蛋白的转运机制
•     2.4 植物ABC转运蛋白的分类及功能
•   3 植物基因克隆技术研究
•     3.1 同源序列克隆
•     3.2 功能克隆
•     3.3 图位克隆
•     3.4 表达序列标签法
•     3.5 差异表达基因克隆技术
•     3.6 转座子标记法
•   4 本研究的目的及意义
• 第二章 材料与方法
•   1 实验材料
•     1.1 材料
•     1.2 菌株
•     1.3 主要试剂
•     1.4 主要仪器设备
•   2 方法
•     2.1 主要试剂及培养基配方
•     2.2 杜仲EuABCF1基因克隆
•     2.3 EuABCF1基因空间表达特征研究
•     2.4 外源处理对EuABCF1基因的诱导
• 第三章 结果与分析
•   1 EuABCF1基因克隆与生物信息学分析
•     1.1 杜仲EuABCF1基因克隆
•     1.2 杜仲EuABCF1蛋白生物信息学分析
•   2 EuABCF1基因空间表达特征
•     2.1 EuACT、EuABCF1扩增及溶解曲线
•     2.2 EuABCF1基因在杜仲中的时空表达分析
•   3 外源处理对EuABCF1基因的诱导
•     3.1 EuACT、EuABCF1扩增及溶解曲线
•     3.2 外源处理对EuABCF1基因的诱导
• 第四章 讨论
•   1 EuABCF1基因克隆及生物信息学分析
•   2 EuABCF1基因空间表达特征
•   3 外源处理对EuABCF1基因的诱导
• 第五章 结论、创新与展望
•   1 结论
•   2 创新和展望
• 参考文献
• 致谢
• 缩略词表
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王磊

导师: 李义,赵懿琛

关键词: 杜仲,转运蛋白,基因克隆,表达分析

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 贵州大学

基金: 国家自然科学基金“杜仲松脂醇双糖苷生物合成关键蛋白DIRIGENT编码基因的克隆与功能分析”(31660076),贵州省教育厅青年科技人才成长项目“杜仲ABC转运蛋白基因克隆与表达分析”(黔教科KY[2016]126)

分类号: Q943.2;S567.19

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