基于微流控技术的单细胞精确操控平台的建立及其在单细胞分析中的应用

论文摘要

细胞是生物体结构和功能的基本单位。传统的细胞分析方法一般是基于大量细胞的平均分析。然而即使是同一类细胞,仍然存在着较大的细胞异质性。因此基于平均的方法掩盖了细胞间的显著性差异,进行单细胞分析具有重要意义。微流控技术由于具有微结构与细胞尺寸匹配、能够精确操控单细胞、检测灵敏度高、通量高、试剂消耗少等优点,目前已被广泛应用于单细胞分析。本文将微流控技术与单细胞分析结合,发展了基于微流控的单细胞精确操控平台,包括单细胞的捕获分离以及单细胞的可控组合,并进行了单细胞蛋白质的异质性分析。具体包括以下三个方面:1.精确操控和配对单细胞/单微球的微流控平台的建立实现单细胞精确操控是进行单细胞分析的重要前提。目前基于微流控技术的单细胞操控平台,如液滴微流控技术虽然能够将单个细胞进行液滴包裹,彼此隔离,但是单细胞包裹率较低,且液滴位置不固定,无法对特定细胞寻址。单细胞捕获阵列虽然能够实现单细胞的高通量捕获及原位观察,但是目前大部分的单细胞捕获阵列,细胞间没有隔离,因此无法避免细胞间的相互影响。为了结合液滴微流控的腔室独立和单细胞阵列的高效捕获和原位观察的优点,本文提出了一种精确操控和配对单细胞/单微球的微流控芯片。该芯片既可以基于流体力学高效捕获单细胞,形成单细胞和单微球的高通量配对阵列,同时通过原位生成包含单细胞和单微球的配对液滴,实现了单细胞间的隔离。并且结合微阀结构,能够灵活操控配对液滴,包括液滴混合,反应液更换等操作。该配对芯片为后续的单细胞分析提供了平台基础。2.基于单细胞和单微球配对平台的单细胞蛋白质分析蛋白质是生命活动的执行者。研究单细胞蛋白质对理解生命过程具有重要意义。检测单细胞蛋白质首先面对的挑战是单细胞蛋白质含量少以及蛋白质无法像核酸一样直接扩增。目前的单细胞蛋白质检测平台,如质谱,流式细胞仪等对单细胞中低丰度蛋白质的检测灵敏度较低,并且仪器价格昂贵。而基于微孔阵列、微阀的微流控平台,细胞分配是基于泊松分布,因此单细胞获取率较低。对此,本文基于精确操控和配对单细胞/单微球的微流控平台,发展了一种新型的单细胞蛋白质分析方法。该方法将160 pL的微液滴作为检测单细胞蛋白质的免疫反应腔体,增加了单细胞蛋白质的局部浓度,提高了单细胞蛋白质的检测灵敏度。同时将多步单细胞蛋白质的检测流程集成化于芯片上,包括单细胞捕获、单细胞裂解、单细胞蛋白质免疫检测等操作,减少了单细胞蛋白质损失。最后基于荧光强度的信号输出方式,实现了高通量单细胞蛋白质的定量检测及异质性分析。该方法为深入研究肿瘤恶化,免疫反应等提供了理论基础。3.基于微流控技术的单细胞可控组合平台的建立多细胞生物实现复杂的生物功能离不开细胞间相互作用。在体外,研究细胞间相互作用,首先需要解决的难点是同型/异型细胞的可控组合。目前的单细胞组合平台,绝大部分是配对两个细胞。将微流控技术和光学,磁学,电学等结合,虽然能够实现数量/种类更多的单细胞组合,但是操作繁琐耗时,设备要求高。其他像微孔阵列,液滴体系等由于是基于泊松分布进行单细胞组合,因此限制了单细胞的组合效率。对此,文本建立了一种基于微流控的单细胞可控组合平台。该芯片通过控制隔离阀的隔离状态,可以进行两种工作模式的转换,分别是单细胞捕获和单细胞转移模式。由于单细胞捕获是基于流体力学,因此捕获效率高。经过重复多轮的单细胞捕获和转移操作,能够实现多重单细胞组合,并且该组合方式能够精确控制单细胞组合的数量及种类。未来可用于单细胞水平的细胞间相互作用研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 单细胞分析
•   1.2 单细胞的精确操控
•     1.2.1 传统的单细胞操控技术
•     1.2.2 基于微流控技术的单细胞精确操控
•   1.3 单细胞蛋白质分析
•     1.3.1 单细胞蛋白质的分析意义
•     1.3.2 单细胞蛋白质的检测技术
•   1.4 本论文的研究目的及研究内容
• 第二章 精确操控和配对单细胞/单微球的微流控平台的建立
•   2.1 引言
•   2.2 实验方案
•   2.3 实验部分
•     2.3.1 仪器,试剂和材料
•     2.3.2 SU-8模板制作
•     2.3.3 PDMS芯片制作
•     2.3.4 细胞染色
•     2.3.5 单细胞和单微球的捕获与配对
•     2.3.6 液滴的生成与混匀
•     2.3.7 配对芯片中间隔离阀的隔离效果考察
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 基于流体动力学的单细胞捕获原理
•     2.4.2 微流控芯片设计
•     2.4.3 SU-8模板结构表征
•     2.4.4 PDMS芯片结构表征
•     2.4.5 基于COMSOL软件的单细胞捕获理论模拟
•     2.4.6 单细胞和单微球的捕获与配对效率
•     2.4.7 捕获腔体的液滴生成及混匀
•     2.4.8 包含单细胞和单微球的配对液滴生成
•     2.4.9 配对芯片中间隔离阀的隔离效果
•   2.5 本章小结
• 第三章 基于单细胞和单微球配对平台的单细胞蛋白质分析
•   3.1 引言
•   3.2 实验方案
•   3.3 实验部分
•     3.3.1 仪器,试剂和材料
•     3.3.2 羧基聚苯乙烯微球偶联捕获抗体
•     3.3.3 配对芯片的预处理
•     3.3.4 单细胞裂解
•     3.3.5 不同浓度PSA标准溶液的检测
•     3.3.6 单细胞胞内蛋白质检测
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 基于配对芯片的单细胞蛋白质分析实验原理
•     3.4.2 羧基聚苯乙烯微球偶联捕获抗体效果验证
•     3.4.3 配对芯片通道表面修饰剂的选择
•     3.4.4 单细胞裂解可行性
•     3.4.5 液滴的体积计算
•     3.4.6 PSA标准曲线绘制
•     3.4.7 单个LNCap细胞胞内PSA蛋白分析
•   3.5 本章小结
• 第四章 基于微流控技术的单细胞可控组合平台的建立
•   4.1 引言
•   4.2 实验方案
•   4.3 实验部分
•     4.3.1 仪器,试剂和材料
•     4.3.2 SU-8模板制作
•     4.3.3 PDMS芯片制作
•     4.3.4 单细胞捕获
•     4.3.5 单细胞转移
•     4.3.6 单细胞组合
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 基于微流控技术的单细胞可控组合原理
•     4.4.2 微流控芯片设计
•     4.4.3 单细胞的捕获和转移效率
•     4.4.4 单细胞的可控组合
•   4.5 本章小结
• 第五章 总结与展望
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘卫枝

导师: 杨朝勇

关键词: 微流控技术,单细胞精确操控,单细胞分析

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,信息科技

专业: 生物学,无线电电子学

单位: 厦门大学

分类号: TN492;Q2-33

总页数: 92

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