PCV2d VLPs在小鼠淋巴结中的动力学研究

论文摘要

病毒样颗粒（Virus-like Particles）的应用起始于人类疫苗的研发,归功于其安全性和有效性,经过几十年的研究,VLPs早已成为各大疫苗研发平台的研究对象。VLP技术的范围不仅体现在疫苗的开发上,而且还体现在药物的传递、材料、生物催化应用上。VLPs为药物递送提供了几个关键优势:1.高效的药物递送比率;2.均一的自组装;3.人工修饰使其功能灵活化;4.大小和形状多种多样;5.毒性低,生物相容性好。本研究首先从湖南省长沙、岳阳、株洲等9地送检病猪共计108份病料中分离抗原性强的毒株。通过对这108份病料进行DNA提取和PCV2 cap基因的PCR检测,结果表明PCV2阳性病料有57份,PCV2检出率为52.7%。对57份PCV2阳性病料中的15份强阳性病料的PCV2全长基因进行测序,得到PCV2a 3份（17.6%）、PCV2b 5份（38.4%）、PCV2d 7份（53.8%）。对5份PCV2b,7份PCV2d进行病毒分离,并得到一株无其他病原体污染的PCV2b（KU317482）,一株无其他病源污染的PCV2d（MH718995）,病毒滴度分别达到105.5TCID50/ml和105.66 TCID50/ml。然后利用流行性较为广泛的PCV2d的cap基因和pET100构建表达载体pET100-H,并利用大肠杆菌表达系统表达PCV2 Cap蛋白,Ni柱纯化后经SDS-PAGE验证并进行PCV2 VLPs的组装,组装产物经透射电镜验证,颗粒直径大小约为17nm的颗粒;经排阻色谱法和间接免疫荧光鉴定为PCV2 VLPs。最后探究PCV2 VLPs在小鼠腘淋巴结中的动力学。足底皮下注射PCV2 VLPs后在规定时间点处死小鼠,取腘淋巴结和腹股沟淋巴结做冰冻切片,用免疫荧光的方法研究VLPs在淋巴结中的动力学。结果显示:1.免疫后PCV2d VLPs以3000μm/min的最大速度,通过自由扩散从足底到达淋巴结;2.PCV2 VLPs分为两部分先后进入膝后窝淋巴结。第一部分PCV2 VLPs通过自由扩散在免疫后5分钟就在膝后窝淋巴结中被检测到,大部分抗原通过导管进入髓质区,小部分抗原通过与非特异性B细胞互作被运输到滤泡内,随着时间的推移VLPs从淋巴结被膜下窦进入浅皮质区并与B细胞共定位,在12h时,自由扩散方式停止,第一部分抗原在髓质区的信号减弱;6h时第二部分抗原通过树突状细胞携带进入淋巴结;3.PCV2 VLPs 1d内活化特异性的B细胞和T细胞。大部分抗原被树突状细胞识别并运输到B细胞和T细胞交界处,小部分抗原经导管被运输到髓质区;4.免疫后第4天第一次观察到初始生发中心的形成,并经过3天的增殖,终形成完整的生发中心,并在生发中心明区发现大量VLPs信号;生发中心反应维持2周后停止,第28天时PCV2 VLPs依旧存在于膝后窝淋巴结皮质区;5.PCV2VLPs未进入腹股沟淋巴结。在腹股沟淋巴结中未检测到PCV2d VLPs的信号。本研究的结果为基于PCV2d VLPs研发的疫苗以及以其为药物载体的研究提供了实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 猪圆环病的发展历史
•   1.2 猪圆环病毒的病原学及分型
•   1.3 PCV2病毒样颗粒的研究进展
•   1.4 PCV2疫苗研究现状
•   1.5 保护性免疫应答研究进展
•     1.5.1 免疫应答的发展
•     1.5.2 保护性免疫应答的过程
•     1.5.3 抗原被树突状细胞捕获
•     1.5.4 抗原被B细胞捕获
•     1.5.5 T细胞的活化
•     1.5.6 B细胞的活化
•     1.5.7 B细胞与树突状细胞的互作
•     1.5.8 B细胞与T细胞在滤泡边缘互作
•     1.5.9 生发中心的形成
•   1.6 疫苗免疫的挑战
•     1.6.1 对抗原吸收的影响
•     1.6.2 对抗原运输的影响
•     1.6.3 对B细胞靶向性的影响
•     1.6.4 对靶向树突状细胞的影响
•     1.6.5 抗原的空间结构
•     1.6.6 抗原在淋巴结中的动力学
•   1.7 本研究的目的及意义
• 第二章 PCV2病毒分离
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 病料来源
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 引物设计与合成
•     2.2.2 病毒DNA提取
•     2.2.3 特异性PCR鉴定
•     2.2.4 病毒分离、增殖和传代培养
•     2.2.5 PCV2分离株全长基因测序
•     2.2.6 分离株同源性分析
•     2.2.7 间接免疫荧光（IFA）的鉴定
•     2.2.8 分离病毒细胞半数感染量（TCID50）的测定
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 病料DNA PCR扩增
•     2.3.2 PCV2病毒基因型的鉴定
•     2.3.3 分离株的细胞培养
•     2.3.4 分离株全基因组的PCR扩增结果
•     2.3.5 间接免疫荧光（IFA）检测
•     2.3.6 分离株TCID50测定
•   2.4 讨论
• 第三章 PCV2d VLPs的组装
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 病料、质粒及菌株
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要设备仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 鉴定重组质粒
•     3.2.2 重组质粒的转化
•     3.2.3 PCV2d Cap蛋白的自诱导表达
•     3.2.4 PCV2d Cap蛋白的可溶性分析
•     3.2.5 PCV2d Cap蛋白的纯化
•     3.2.6 PCV2d VLPs的组装
•     3.2.7 空间排阻色谱分析
•     3.2.8 透射电子显微镜观察
•     3.2.9 间接免疫荧光
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 重组质粒鉴定
•     3.3.2 SDS-PAGE鉴定PCV2d Cap蛋白的表达和纯化
•     3.3.3 排阻色谱分析
•     3.3.4 PCV2d VLPs形态学观察
•     3.3.5 间接免疫荧光分析PCV2d VLPs的抗原性
•   3.4 讨论
• 第四章 PCV2 VLPs在小鼠淋巴结中的动力学研究
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 动物模型选择
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 BCA试剂盒测定PCV2 VLPs浓度
•     4.2.2 免疫动物方案
•     4.2.3 冰冻切片免疫组化
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 VLPs在小鼠腘淋巴结中的动力学
•     4.3.2 VLPs在小鼠腹股沟淋巴结中的动力学
•     4.3.3 VLPs与树突状细胞的互作
•   4.4 讨论
• 第五章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 贺延峰

导师: 邓治邦

关键词: 猪圆环病毒,病毒样颗粒,动力学,疫苗研发

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 湖南农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000619

总页数: 69

文件大小: 3444k