苹果U6启动子的克隆及功能分析

论文摘要

【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果（Malus×domestica）上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA(E-value<3e-40),分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作为候选U6启动子。序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件（Upstream sequence element,USE）和TATA-Like box。瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子（长度分别为1 500、959、275和116 bp）中275 bp的启动子活性最强。另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子。【结论】从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子。

论文目录

• 0 引言
• 1 材料与方法
•   1.1 试验材料
•   1.2 苹果U6启动子克隆及表达载体构建
•   1.3 MdU6启动子序列元件分析
•   1.4 本氏烟草种植
•   1.5 本氏烟草叶片中瞬时表达分析
•   1.6 苹果愈伤组织中瞬时表达分析
•   1.7 生物发光检测
•   1.8 数据分析
• 2 结果
•   2.1 MdU6启动子序列比对分析
•   2.2 苹果U6启动子的克隆及鉴定
•   2.3 苹果U6启动子转录活性鉴定
•   2.4 MdU6-10P元件分析
•   2.5 MdU6-10-Ps的克隆及鉴定
•   2.6 MdU6-10-Ps转录活性鉴定
•   2.7 苹果和拟南芥U6启动子转录活性比较
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 卞书迅,韩晓蕾,袁高鹏,张利义,田义,张彩霞,丛佩华

关键词: 苹果,启动子,荧光素酶,本氏烟草,愈伤组织

来源: 中国农业科学 2019年23期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,园艺

单位: 中国农业科学院果树研究所/农业部园艺作物种质资源利用重点实验室/国家苹果育种中心

基金: 国家现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-27),中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP-2016-RIP-02),辽宁省博士科研启动基金(20180540030),中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610182019007)

分类号: S661.1;Q943.2

页码: 4364-4373

总页数: 10

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