AcrⅤA5蛋白抑制TypeⅤ-A型CRISPR-Cas系统的分子机制

论文摘要

CRISPR-Cas适应性免疫系统为细菌和古细菌对抗噬菌体和质粒入侵提供了核酸序列特异性的防御机制,分为TypeⅠ至TypeⅥ六种类型,其中TypeⅡ、TypeⅤ和TypeⅥ系统的效应蛋白为单个蛋白组成,而其他类型Cas蛋白由多个亚基组成。在噬菌体感染细菌的过程中,细菌的Cas效应蛋白例如Cas9或者Cas12a在RNA指导下通过PI（PAM-interacting）结构域识别靶向dsDNA的PAM序列并解旋dsDNA,其核酸酶结构域切割噬菌体基因组DNA,抵御噬菌体的入侵。作为对CRISPR-Cas免疫系统的反击,噬菌体通过突变、编码anti-CRISPR蛋白等一系列策略来逃逸细菌的CRISPR-Cas系统。目前通过各种方法鉴定得到了众多针对多种类型系统的anti-CRISPR蛋白,在已经报道的anti-CRISPR蛋白抑制机制的相关研究中,这些蛋白都是通过与Cas效应蛋白复合物直接结合从而阻止靶向dsDNA结合的方式抑制CRISPR-Cas系统的活性,而针对TypeⅤ型CRISPR-Cas12a系统的anti-CRISPR蛋白尚未被发现,其抑制CRISPR-Cas系统的机制也是未知的。本论文旨在通过生物信息学方法发现TypeⅤ型CRISPR-Cas系统的anti-CRISPR蛋白,并通过生化、结构生物学方法研究其抑制机制,以填补TypeⅤ型anti-CRISPR蛋白研究领域的空白。本研究首先从细菌基因组数据中寻找TypeⅤ-A亚型CRISPR-Cas系统,并依据Self-Targeting的方法从莫拉克斯氏菌属（Moraxella bovoculi）22581菌株前噬菌体基因序列中,预测得到了有可能抑制CRISPR-Cas12a系统的50个anti-CRISPR候选蛋白,随后通过体内靶向质粒的实验和体外剪切抑制实验,从中筛选到了能够有效抑制CRISPR-Cas12a系统的AcrⅤA4和AcrⅤA5蛋白。凝胶过滤实验、Pull-Down实验和电泳迁移率实验结果显示AcrⅤA4蛋白是通过与MbCas12a-cr RNA复合物相结合的方式抑制靶向dsDNA的结合从而发挥其抑制功能的,而AcrⅤA5蛋白不与MbCas12a效应复合物相结合,但仍然通过阻止dsDNA的结合发挥其抑制功能。随后的生化实验结果显示,AcrⅤA5蛋白是一个乙酰转移酶,它通过乙酰化修饰作用使MbCas12a蛋白失去切割dsDNA的能力,我们通过质谱结果分析MbCas12a蛋白的乙酰化位点,结合Lb Cas12a蛋白结构数据,进一步确定了氨基酸残基K635的乙酰化是导致MbCas12a蛋白失活的关键因素。本研究通过蛋白晶体X射线衍射技术和单颗粒冷冻电镜技术分别解析了AcrⅤA5晶体2.1?和MbCas12a蛋白3.6?分辨率的三维结构。AcrⅤA5蛋白晶体结构显示,单个AcrⅤA5蛋白分子由两个交叉的α螺旋束包裹着5股反平行的β折叠片组成,两个AcrⅤA5分子各结合一分子乙酰辅酶A形成同源二聚体结构。MbCas12a-cr RNA复合物的三维结构显示,其负责PAM识别的PI结构域中第635位赖氨酸的侧链氨基发生了明显的乙酰化作用,提供了分子水平上乙酰化作用发生的直接证据。生化实验结果和进一步的结构分析显示,AcrⅤA5蛋白通过乙酰化修饰MbCas12a蛋白PI结构域PAM识别关键的Lys635侧链ε-氨基,产生空间位阻效应,阻止了MbCas12a蛋白对PAM序列中关键T碱基的识别,从而阻碍了靶向dsDNA的结合,抑制了CRISPR-Cas12a系统的功能。根据结构对AcrⅤA5蛋白进行单点突变,体外剪切抑制实验结果显示,Lys2、Lys29、Gly32、Gly34、Ser35的突变使AcrⅤA5蛋白几乎失去了抑制活性。其中Lys2和Asp85之间的盐桥相互作用与维持AcrⅤA5蛋白二聚体结构密切相关,而Lys29、Gly32、Gly34、Ser35在AcrⅤA5与Ac Co A分子的结合中发挥着关键作用。MbCas12a蛋白Lys635突变为Arg后,体外剪切抑制实验显示AcrⅤA5蛋白不能抑制其剪切dsDNA的活性,而其源于M.bovoculi 22581菌株中同源蛋白Mb2Cas12a负责PAM识别的关键氨基酸为Arg625,具有抵抗AcrⅤA5蛋白乙酰化修饰的能力,当突变为赖氨酸时,受AcrⅤA5蛋白抑制失活,进一步证实了AcrⅤA5蛋白通过乙酰化修饰MbCas12a蛋白Lys635侧链ε-氨基,阻止MbCas12a蛋白对PAM序列中关键T碱基的识别,从而阻碍靶向dsDNA结合的分子机制。本研究论文首次解析了TypeⅤ型anti-CRISPR蛋白AcrⅤA5的晶体结构以及MbCas12a蛋白的单颗粒冷冻电镜结构,通过结构分析和生化实验阐明了AcrⅤA5蛋白通过乙酰化共价修饰的方式使CRISPR-Cas系统失活的机制。这种通过酶催化反应的方式使CRISPR-Cas系统失活的机制不同于以往发现的anti-CRISPR蛋白直接结合抑制Cas蛋白的策略,拓展了我们对于噬菌体利用anti-CRISPR蛋白抑制细菌CRISPR免疫系统的理论认识。该研究对理解噬菌体与细菌或者古细菌之间不断进化的军备竞赛有重要的科学意义。本论文中对anti-CRISPR蛋白AcrⅤA5抑制Cas12a蛋白分子机制的研究为开发控制Cas12a基因编辑系统的工具提供了结构基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 课题背景及研究的目的和意义
•   1.2 CRISPR-Cas系统的发现、分类和功能机制
•     1.2.1 细菌或古细菌中CRISPR阵列的发现
•     1.2.2 CRISPR-Cas系统的分类和功能
•     1.2.3 TypeⅤ型效应蛋白Cas12a的功能机制
•   1.3 CRISPR-Cas系统的基因编辑应用和调控
•     1.3.1 CRISPR-Cas基因编辑系统的应用
•     1.3.2 CRISPR-Cas免疫防御系统的调控
•   1.4 噬菌体与细菌或古细菌的相互作用
•     1.4.1 细菌或者古细菌对抗噬菌体的防御机制
•     1.4.2 噬菌体对抗细菌或者古细菌的机制
•   1.5 Anti-CRISPR蛋白的发现、种类和作用机制
•     1.5.1 Anti-CRISPR蛋白的发现和种类
•     1.5.2 Anti-CRISPR蛋白的作用机制
•     1.5.3 Anti-CRISPR蛋白的应用
•   1.6 本文的主要研究内容及技术路线
• 第2章 实验材料与方法
•   2.1 实验试剂与仪器
•     2.1.1 实验试剂与实验材料
•     2.1.2 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 TypeⅤ型anti-CRISPR候选蛋白的预测与筛选
•     2.2.2 实验所需试剂的配制
•     2.2.3 RNA的转录与纯化
•     2.2.4 目的蛋白的表达与纯化
•     2.2.5 质谱检测分析
•     2.2.6 AcrⅤA5蛋白的结晶、优化与解析
•     2.2.7 冷冻电镜技术样品制备和数据收集
•     2.2.8 体内Plasmid-Targeting实验
•     2.2.9 体外抑制实验
•     2.2.10 电泳迁移率实验
•     2.2.11 蛋白质相互作用实验
• 第3章 TypeⅤ型anti-CRISPR蛋白的筛选
•   3.1 引言
•   3.2 Guilt-by-association/Self-Targeting引导对anti-CRISPRs的发现
•   3.3 TypeⅤ型anti-CRISPR蛋白的生物信息学预测与筛选
•   3.4 TypeⅤ型anti-CRISPR候选蛋白的体内抑制实验
•   3.5 TypeⅤ型anti-CRISPR候选蛋白的体外抑制实验
•   3.6 本章小结
• 第4章 Cas12a、Acr VA4和Acr VA5 的纯化与相互作用分析
•   4.1 引言
•   4.2 AcrⅤA4蛋白的亲和纯化和层析分离
•   4.3 AcrⅤA5蛋白的亲和纯化和层析分离
•   4.4 crRNA的纯化
•     4.4.1 T7RNA聚合酶的纯化
•     4.4.2 pre-cr RNA的转录与纯化
•   4.5 Cas12a蛋白的表达纯化
•     4.5.1 MbCas12a蛋白的亲和纯化和层析分离
•     4.5.2 MbCas12a和 AcrⅤA5 蛋白的共表达和纯化
•     4.5.3 Mb2Cas12a蛋白的亲和纯化和层析分离
•     4.5.4 Lb Cas12a蛋白的亲和纯化和层析分离
•     4.5.5 Lb2Cas12a蛋白的亲和纯化和层析分离
•   4.6 MbCas12a与 AcrⅤA4、AcrⅤA5 的相互作用
•     4.6.1 MbCas12a与 AcrⅤAs蛋白的GST Pull-Down实验
•     4.6.2 MbCas12a与 AcrⅤAs蛋白的凝胶过滤实验
•   4.7 AcrⅤAs抑制MbCas12a切割ds DNA
•     4.7.1 AcrⅤAs蛋白体外抑制MbCas12a
•     4.7.2 AcrⅤA5 属于GNAT乙酰转移酶超家族蛋白
•     4.7.3 AcrⅤA5 通过乙酰化修饰MbCas12a蛋白使其失活
•   4.8 本章小结
• 第5章 Acr VA5和MbCas12a蛋白的分子结构
•   5.1 引言
•   5.2 AcrⅤA5蛋白的结晶与数据处理
•     5.2.1 AcrⅤA5蛋白的晶体筛选和优化
•     5.2.2 AcrⅤA5蛋白晶体防冻液的配制和晶体冻存
•     5.2.3 AcrⅤA5蛋白晶体的数据收集
•     5.2.4 AcrⅤA5蛋白晶体的结构解析
•     5.2.5 AcrⅤA5蛋白的结构分析
•   5.3 LC-MS/MS质谱分析MbCas12a乙酰化位点
•   5.4 MbCas12a蛋白的冷冻电镜结构和数据处理
•     5.4.1 MbCas12a蛋白样品的准备
•     5.4.2 MbCas12a蛋白冷冻电镜数据的收集
•     5.4.3 MbCas12a蛋白冷冻电镜数据的处理
•     5.4.4 MbCas12a蛋白结构建模和精修
•     5.4.5 MbCas12a蛋白结构分析
•   5.5 本章小结
• 第6章 AcrVA5乙酰化失活MbCas12a的分子机制
•   6.1 引言
•   6.2 AcrⅤA5与AcCo A的结合机制
•     6.2.1 AcrⅤA5二聚体的结构分析
•     6.2.2 AcrⅤA5与AcCo A结合的结构分析
•   6.3 AcrⅤA5乙酰转移酶催化机制
•   6.4 MbCas12a蛋白切割dsDNA机制
•     6.4.1 MbCas12a蛋白的结构组成
•     6.4.2 MbCas12a切割靶向dsDNA的机制
•     6.4.3 与PAM识别相关的氨基酸残基
•   6.5 AcrⅤA5 通过乙酰化PI结构域关键Lys使 MbCas12a失活
•     6.5.1 AcrⅤA5蛋白乙酰化修饰MbCas12a蛋白的分子机制
•     6.5.2 Mb2Cas12a抵抗AcrⅤA5的乙酰化修饰作用
•     6.5.3 AcrⅤA5 失去对MbCas12a（K635R）蛋白的抑制作用
•     6.5.4 对AcrⅤA5抑制机制的再验证
•     6.5.5 AcrⅤA5在M.bovoculi菌株Prophage中的分布
•   6.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 董立永

导师: 黄志伟

关键词: 蛋白,系统,乙酰化,单颗粒冷冻电镜

来源: 哈尔滨工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 哈尔滨工业大学

基金: 国家杰出青年科学基金项目“病毒与宿主免疫系统相互作用的分子机制(No.31825008)”

分类号: Q78

DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.005283

总页数: 174

文件大小: 11418k