里氏木霉中CRISPR-Cas9基因组编辑及木糖调控基因表达方法的建立

论文摘要

里氏木霉（Trichoderma reesei）是生产纤维素酶的重要工业菌株,同时也可用于表达多种外源蛋白,但目前对其进行基因组编辑的技术尚不成熟,表达严重依赖于CBH1表达系统。本论文对里氏木霉中的基因组编辑进行了研究,并尝试开发了CBH1的补充表达系统。本研究取得了如下结果:1.CRISPR-Cas9技术在里氏木霉的初步建立本研究通过胞内表达Cas9和体外装载Cas9-gRNA两种方法进行基因敲除以及在此基础上定点插入基因的方法。首先,在里氏木霉QM9414菌株胞内表达Cas9,并转化体外转录的gRNA,得到了5-FOA抗性的转化子,ura5基因发生了脱靶的基因编辑现象,在靶位点下游70-和100-bp处插入/缺失9-或12-bp。其次,将胞外组装的Cas9-gRNA和带有pyr4标记基因的质粒共转化到里氏木霉TU-6菌株,当靶向主要的外切纤维素酶cbh1时,发现在27个转化子中有8个转化子失去了表达CBH1的能力,这表明通过基因组编辑成功地敲除了cbh1基因。进一步的序列分析表明,在靶位点处插入了共转化质粒、染色体基因,或两者的混合物。此外,研究了定点插入基因的方法,在HDR介导的基因替换中,将Cas9-gRNA和11.7-kb的donor DNA共转到里氏木霉SUS1菌株,从143个转化子中发现有5个转化子在假定的β-葡萄糖苷酶celc3靶位点精确地整合了漆酶表达盒片段。2.在里氏木霉中使用木糖调控基因表达转录因子为基础的生物传感器技术已经发展成为一种从动态水平上反应胞内蛋白质的表达水平,而木糖作为木质纤维素的主要成分木聚糖的单体,在生物体的利用还不是非常广泛。本研究利用枯草芽孢杆菌来源的转录因子XylR和木霉自身经改造的77481强启动子,建立了细胞内以红色荧光蛋白DsRed为报告基因的生物传感器。该系统中,DsRed的荧光信号和木糖剂量间呈现出一种明显的剂量反应,且DsRed的相对转录水平有了显著提高。另外,除了木糖,其它如葡萄糖、甘露糖等也可以与转录因子结合,但其强度不如木糖与XylR相互作用。在此基础上,构建了xylR和man5a的重组表达菌株,与cbh1启动子启动的man5a表达相比,该系统可以在使用木糖、葡萄糖甚至甘露聚糖等碳源的诱导下,表现出相对较高的甘露聚糖酶酶活。本研究提供了一种充分利用木质纤维素降解过程中产生的多种小分子糖为诱导物,是CBH1系统的有益补充。本研究通过直接转化体外装载的Cas9-gRNA到里氏木霉,建立了一种快速敲除目的基因的方法,在菌株改良和功能基因组学研究中具有广阔的应用前景。同时尝试在里氏木霉体内构建以细菌转录因子为基础的生物传感器,利用糖结合转录因子使其构象发生变化从而离开启动子的特点设计了使用木糖来调控外源基因的表达,拓展了木质纤维素降解物在诱导里氏木霉中的应用。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 里氏木霉表达系统
•     1.1.1 里氏木霉简介
•     1.1.2 里氏木霉的纤维素酶体系
•     1.1.3 里氏木霉的遗传改造背景
•       1.1.3.1 里氏木霉的筛选标记
•       1.1.3.2 里氏木霉的突变菌株
•       1.1.3.3 里氏木霉的遗传改造现状
•   1.2 基因组编辑技术
•     1.2.1 基因组编辑技术的种类
•       1.2.1.1 ZFN技术和TALEN的简介
•       1.2.1.2 CRISPR/Cas9 技术
•       1.2.1.3 CRISPR/Cas的基因座结构
•     1.2.2 CRISPR/Cas9 的作用机理
•     1.2.3 CRISPR/Cas9 系统的的特点
•     1.2.4 CRISPR/Cas9 系统的应用
•       1.2.4.1 基因组编辑
•       1.2.4.2 转录调控
•       1.2.4.3 基因治疗
•     1.2.5 CRISPR/Cas9 在丝状真菌的研究现状
•       1.2.5.1 研究进展
•       1.2.5.2 存在问题
•   1.3 生物传感器
•     1.3.1 生物传感器技术的研究背景
•     1.3.2 生物传感器的应用
•       1.3.2.1 高通量筛选方法的实现
•       1.3.2.2 动态代谢通路的控制
•     1.3.3 常用的生物传感器种类
•       1.3.3.1 光反应性转录因子-生物传感器
•       1.3.3.2 转录因子-生物传感器
•     1.3.4 生物传感器研究中亟需解决的问题
•   1.4 本研究的内容及意义
•     1.4.1 本研究的内容
•     1.4.2 本研究的意义
• 第二章 CRISPR-Cas9 基因组编辑方法在里氏木霉的建立
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 实验仪器及生化试剂
•     2.1.3 培养基及溶液配制
•     2.1.4 引物
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 胞内表达Cas9 编辑ura5 基因
•       2.2.1.1 cas9 基因的克隆
•       2.2.1.2 组成型表达的pPdc1-cas9 质粒的构建
•       2.2.1.3 cas9 表达质粒转化及阳性转化子的筛选
•       2.2.1.4 转化子的cas9 基因表达水平测定
•       2.2.1.5 gRNA（ura5）的制备
•       2.2.1.6 里氏木霉中CRISPR-Cas9 系统介导的ura5 的突变
•     2.2.2 Cas9/gRNA复合物对里氏木霉cbh1 基因的敲除
•       2.2.2.2 Cas9/gRNA（cbh1）复合物的转化
•       2.2.2.3 里氏木霉cbh1 基因的敲除
•     2.2.3 Cas9/gRNA介导celc3 靶位点的定点替换
•       2.2.3.1 gRNA（celc3）的合成
•       2.2.3.2 Donor DNA的构建
•       2.2.3.3 celc3 靶位点的定点替换
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 胞内表达Cas9 编辑ura5 基因
•       2.3.1.1 pPdc1-cas9 质粒的构建
•       2.3.1.2 阳性转化子的筛选
•       2.3.1.3 cas9 基因转录水平的测定
•       2.3.1.4 细胞内表达Cas9对ura5 基因的编辑结果
•     2.3.2 Cas9/gRNA复合体对里氏木霉cbh1 基因的敲除
•       2.3.2.1 Cas9/gRNA体外切割cbh
•       2.3.2.2 TU-6 菌株中cbh1 基因的敲除
•     2.3.3 Cas9/gRNA介导celc3 位点的定点替换
•       2.3.3.1 Cas9/gRNA作用于celc3 位点的定点插入示意图
•       2.3.3.2 Cas9/gRNAs体外切割celc3 位点
•       2.2.3.2 Donor DNA的构建
•       2.3.3.3 celc3 位点的定点插入验证
•   2.4 讨论
• 第三章 在里氏木霉中使用木糖调控基因表达方法的建立
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株与质粒
•     3.1.2 实验仪器及生化试剂
•     3.1.3 培养基及溶液配制
•     3.1.4 引物
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 枯草芽孢杆菌来源的XylR与不同小分子糖的结合能力分析
•       3.2.1.1 pET28a-bsxylR原核表达载体的构建
•       3.2.1.2 Bs XylR转录因子的原核表达
•     3.2.2 pAPA-7xxDsRed、pAPA-7DsRed等重组质粒的构建
•       3.2.2.1 bsxylR等相关基因的克隆
•       3.2.2.2 pAPA-bsxylR重组载体的构建
•       3.2.2.3 pAPA-7xxD重组载体的构建
•       3.2.2.4 pAPA-7DsRed重组载体的构建
•     3.2.3 重组菌株的转化及红色荧光蛋白的表达
•     3.2.4 pAPA-7xxDsRed重组菌株对木糖的响应范围的测定
•     3.2.5 pAPA-7xxDsRed重组菌株的部分基因的RT-qPCR分析
•     3.2.6 重组菌株在不同糖作用中的表达分析
•     3.2.7 木糖调控的生物传感器在木霉菌株中的进一步应用
•       3.2.7.1 pAPA-7xxman5a重组表达载体的构建
•       3.2.7.2 pAPA-Pcbh1-man5a重组表达载体的构建
•       3.2.7.3 重组质粒转化里氏木霉
•       3.2.7.4 甘露聚糖酶的表达及酶活测定
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 枯草芽孢杆菌来源的XylR与不同小分子糖的结合力分析
•       3.3.1.1 重组表达质粒pET-28a（+）-bsxylR的构建
•       3.3.1.2 Bs XylR转录因子的原核表达
•     3.3.2 pAPA-7xxDsRed、pAPA-7DsRed等重组质粒的构建
•     3.3.3 重组菌株的转化及红色荧光蛋白的表达
•     3.3.4 两个重组菌株对木糖的响应范围的测定
•     3.3.5 pAPA-7xxDsRed重组菌株的部分基因的RT-qPCR分析
•     3.3.6 重组菌株在不同碳源中的表达分析
•     3.3.7 木糖调控的生物传感器在木霉菌株中的进一步应用
•       3.3.7.1 pAPA-7xxman5a重组表达质粒的构建
•       3.3.7.2 pAPA-Pcbh1-man5a重组表达质粒的构建
•       3.3.7.4 甘露聚糖酶的表达及酶活测定
•   3.4 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郝珍珍

导师: 苏小运

关键词: 里氏木霉,生物传感器,木糖

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国农业科学院

分类号: Q78

总页数: 74

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