全文摘要
本发明提供了一种基于通心络预处理的心肌细胞来源外泌体及其制备方法。本发明提供一种心肌细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理心肌细胞，并对预处理过的心肌细胞行缺氧\/复氧处理后收集其分泌的外泌体。本发明可制备出具有减少心肌微血管内皮细胞凋亡、从而减轻心肌缺血再灌注损伤功效的心肌细胞来源外泌体。
主设计要求
1.一种心肌细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理心肌细胞，并对预处理过的心肌细胞行缺氧\/复氧处理后收集其分泌的外泌体。
设计方案
1.一种心肌细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理心肌细胞，并对预处理过的心肌细胞行缺氧\/复氧处理后收集其分泌的外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，采用通心络预处理心肌细胞的过程包括：
在心肌细胞的DMEM培养基中加入通心络1～6小时后，更换细胞培养基为无通心络的DMEM培养基，进行缺氧\/复氧处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缺氧\/复氧处理的过程包括：
通心络预处理后的心肌细胞于厌氧、37℃、5％CO2<\/sub>中缺氧处理18小时；缺氧18小时后，复氧2小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，复氧结束后收集条件培养基，并利用离心法分离得到经通心络处理和缺氧\/复氧刺激的心肌细胞分泌的外泌体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，离心法包括：
收集条件培养基后，依次离心去除细胞、离心去除细胞碎片、离心去除大囊泡，然后离心收取沉淀并重悬后，再次离心获得外泌体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，收集条件培养基后，300g离心10min去除细胞；2000g离心20min去除细胞碎片；16500g高速离心30min去除大囊泡；120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后，再次120000g超速离心70min获得外泌体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述心肌细胞为人心肌细胞。
8.一种外泌体，其是按照权利要求1～7任一项所述的方法制备得到的。
9.通心络在制备促进心肌细胞在缺氧\/复氧后分泌具有减少心脏微血管内皮细胞凋亡并减轻心肌缺血再灌注损伤的外泌体的制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，利用400μg\/ml通心络预处理心肌细胞1～6小时。
设计说明书
技术领域
本发明是关于一种基于药物预处理的心肌细胞来源外泌体及其制备方法，具体是关于一种基于药物通心络预处理的心肌细胞来源外泌体及其制备方法。
背景技术
WHO统计数据表明：2016年心血管疾病是全球第一大死因(约1760万人，32.2％)，其中有948万人死于缺血性心脏病(17.3％)(Collaborators GM.Global,regional,andnational under-5 mortality,adult mortality,age-specific mortality,and lifeexpectancy,1970–2016:a systematic analysis for the Global Burden of DiseaseStudy 2016.The Lancet 2017；390(10100):1084-1150；Collaborators GCOD.Global,regional,and national age-sex specific mortality for 264 causes of death,1980–2016:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study2016.The Lancet 2017；390(10100):1151-1210)。急性心肌梗死(acute myocardialinfarction,AMI)可导致大量心肌缺血坏死，进而致残致死。及时有效的再灌注治疗(如经皮冠状动脉介入治疗)是AMI时挽救心肌的最有效方法(Anderson,J.L.,and Morrow,D.A.(2017).Acute myocardial infarction.N.Engl.J.Med.376,2053–2064.)。然而，再灌注治疗的同时也因为引发“氧化应激”或“钙超载”等反应而引起心肌细胞的损伤，即心肌缺血再灌注损伤(Yellon,D.M.,and Hausenloy,D.J.(2007).Myocardial reperfusioninjury.N.Engl.J.Med.357,1121–1135.)。据报道，再灌注治疗可减少40％的心肌细胞死亡，而剩余的死亡心肌细胞中，却有30％是由再灌注损伤引起的(Yellon,D.M.,andHausenloy,D.J.(2007).Myocardial reperfusion injury.N.Engl.J.Med.357,1121–1135.)。因此，减轻心肌缺血再灌注损伤可改善AMI患者预后，减少国家的疾病负担。然而，目前尚无有效药物可减轻心肌缺血再灌注损伤(Heusch,G.(2015).Molecular basis ofcardioprotection:signal transduction in ischemic pre-,post-,and remoteconditioning.Circ.Res.116,674–699)。
外泌体具有来源广、稳定、无免疫原性等优点，有望减轻心肌缺血再灌注损伤，成为新一代的心肌修复产品(Lamichhane TN,Sokic S,Schardt JS,Raiker RS,Lin JW,JaySM.Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Tissue Engineering andRegenerative Medicine.Tissue Engineering Part B:Reviews 2015；21(1):45-54)。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种心肌细胞来源外泌体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所制备的心肌细胞来源外泌体。
本发明的研究发现，通心络(Tongxinluo,TXL)预处理心肌细胞，可制备出具有减少心肌微血管内皮细胞凋亡、从而减轻心肌缺血再灌注损伤功效的心肌细胞来源外泌体。
一方面，本发明提供了一种心肌细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理心肌细胞，并对预处理过的心肌细胞行缺氧\/复氧处理后收集其分泌的外泌体。
本发明中所用通心络(Tongxinluo,TXL)为一种药物，其应符合相关质量标准要求。
根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法包括：
药物通心络预处理心肌细胞；更换培养基；缺氧处理及复氧处理心肌细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，采用通心络预处理心肌细胞的过程包括：
在心肌细胞的DMEM培养基中(无糖、无血清、无外泌体等)加入通心络1～6小时后，更换细胞培养基为无通心络的DMEM培养基，进行缺氧\/复氧处理。
根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，所述缺氧\/复氧处理为缺氧18小时\/复氧2小时处理，具体的过程包括：
通心络预处理后的心肌细胞于厌氧、37℃、5％CO2<\/sub>中缺氧处理18小时；缺氧18小时后，复氧2小时。
根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，复氧结束后收集条件培养基，并利用离心法分离得到经通心络处理和缺氧\/复氧刺激的心肌细胞分泌的外泌体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，离心法包括：收集条件培养基后，依次离心去除细胞、离心去除细胞碎片、离心去除大囊泡，然后离心收取沉淀并重悬后，再次离心获得外泌体。
具体地，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，离心法包括：收集条件培养基后，300g离心10min去除细胞；2000g离心20min去除细胞碎片；16500g高速离心30min去除大囊泡；120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后，再次120000g超速离心70min获得外泌体。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法包括：
心肌细胞弃去培养基，冲洗干净以去除残留的完全培养基，加入溶有通心络的DMEM培养基(无糖、无血清、无外泌体等)，处理细胞1～6小时(期间维持心肌细胞的正常培养状态)；更换培养基为无通心络的DMEM培养基(无糖，无血清、无外泌体等)，置于含厌氧指示条(BioMérieux，96118)的缺氧盒(BioMérieux，96127)中，放入厌氧袋(Mitsubishi GasChemical Company，C-1)，迅速关闭缺氧盒；将缺氧盒置于37℃、5％CO 2<\/sub>细胞培养箱中，缺氧处理18小时。注：此缺氧装置完全清除缺氧盒中的氧气需2.5小时，而在缺氧袋放入1.5小时后盒内便已达低氧状态(指示条由蓝色变白)。本发明的缺氧处理时间并不计算将细胞置入缺氧盒中的最开始1.5小时。缺氧18小时后，在无菌操作台里将培养瓶(板)盖子打开，摇晃培养基以促使细胞迅速复氧，再盖好盖子放回培养箱复氧2小时。
根据本发明的具体实施方案，本发明的心肌细胞来源外泌体的制备方法中，所述心肌细胞为人心肌细胞(Promocell,C-12810)。
另一方面，本发明还提供了按照本发明所述方法制备得到的外泌体。与现有技术得到的外泌体相比，本发明制备的外泌体linc-ROR含量更高，其中linc-ROR可减轻缺氧\/复氧(缺血再灌注)引起的损伤。
另一方面，本发明还提供了通心络在制备促进心肌细胞在缺氧\/复氧后分泌具有减少心脏微血管内皮细胞凋亡并减轻心肌缺血再灌注损伤的外泌体的制剂中的应用。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，利用400μg\/ml通心络预处理心肌细胞1～6小时。
另一方面，本发明还提供了一种促进心肌细胞分泌外泌体的方法，该方法包括：
采用通心络预处理心肌细胞，并对预处理过的心肌细胞行缺氧\/复氧处理，促进心肌细胞分泌外泌体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的促进心肌细胞分泌外泌体的方法中，是利用本发明前述的方法处理心肌细胞，促进心肌细胞分泌具有减少心脏微血管内皮细胞凋亡并减轻心肌缺血再灌注损伤的外泌体。
根据本发明的具体实施方案，其中，促进心肌细胞分泌外泌体包括上调外泌体中linc-ROR的表达水平。即，本发明还提供了上调心肌细胞来源外泌体中linc-ROR的表达水平的方法，该方法包括利用本发明前述的方法处理心肌细胞，促进心肌细胞分泌linc-ROR含量更高的外泌体。
在本发明的一个具体实施方案中，利用400μg\/ml TXL预处理后用缺氧(18小时)\/复氧(2小时)刺激心肌细胞可获得linc-ROR含量更高的外泌体，可减少缺氧\/复氧(缺血\/再灌注)引起的微血管内皮细胞凋亡和减轻心肌缺血再灌注损伤。
附图说明
图1显示不同浓度TXL对心肌细胞活性的影响。
图2A-图2B显示缺氧\/复氧刺激TXL预处理心肌细胞及无TXL预处理心肌细胞后所获条件培养基对缺氧\/复氧引起的微血管内皮细胞凋亡的作用差异。
图3A-图3B显示本发明心肌细胞来源外泌体的鉴定结果。
图4A-图4B显示TXL预处理及缺氧\/复氧刺激的心肌细胞来源外泌体减少缺氧\/复氧引起微血管内皮细胞凋亡的检测结果。
图5A-图5B显示TXL预给药1小时可显著减少缺血再灌注后的心梗面积，而该作用由外泌体介导。
图6A-图6B显示经TXL预处理心肌细胞缺氧\/复氧时对微血管内皮细胞的保护作用与上调其外泌体中linc-ROR有关的检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例中所用TXL购自石家庄以岭药业股份有限公司，其主要成分如下：
申请码:申请号:CN201910535074.8 申请日:2019-06-20 公开号:CN110257323A 公开日:2019-09-20 国家:CN 国家/省市:11(北京) 授权编号:授权时间:主分类号:C12N 5/077 专利分类号:C12N5/077;A61K35/34;A61P9/10;A61P9/00 范畴分类:18H; 申请人:中国医学科学院阜外医院 第一申请人:中国医学科学院阜外医院 申请人地址:100037 北京市西城区北礼士路167号 发明人:杨跃进;陈桂浩;黄沛森 第一发明人:杨跃进 当前权利人:中国医学科学院阜外医院 代理人:韩蕾;李辉 代理机构:11127 代理机构编号:北京三友知识产权代理有限公司 优先权:关键词:当前状态:审核中 类型名称:外观设计
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